MicroRNA-146a在结核分枝杆菌感染中的作用及相关机制研究

摘要

据世界卫生组织报道，目前全球有近1/3的人感染结核分枝杆菌。全球有活动性肺结核病人约2000万，每年新发结核病人约800-1000万，每年约有300万人死于结核病。结核病已成为全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。近年来，由于结核分枝杆菌耐多药菌株的流行及艾滋病毒结核分枝杆菌合并感染等原因，结核病的防控形势越加严峻，深入研究结核病的感染和发病机制显得更为急迫。结核分枝杆菌是典型的胞内致病菌，其表面存有多种糖脂成分，可被巨噬细胞表面众多模式识别受体如补体受体、甘露糖受体、TLRs及NLRs识别进入巨噬细胞。作为最主要的固有免疫细胞和抗原递呈细胞之一，巨噬细胞是宿主控制结核分枝杆菌感染播散的重要防御屏障。然而同时，巨噬细胞亦是结核分枝杆菌的宿主细胞，在结核感染、繁殖、扩散过程中起到了关键的作用。结核分枝杆菌进入巨噬细胞后一方面可被细胞消化清除，另一方面可通过诸多逃逸机制避免机体的杀伤，并在细胞内存活繁殖。感染导致的不同结局可能取决于细菌的毒力以及巨噬细胞本身的活化状态。因此，研究固有免疫中巨噬细胞与结核分枝杆菌的相互作用，对了解机体在感染早期对于结核分枝杆菌的清除十分重要。microRNA (miRNA)是一类新发现的长度约为20～24 nt的非编码单链小分子RNA，可与靶基因mRNA3'非编码区(3'-untranslated region-UTR)结合，降解靶基因 mRNA 或抑制靶基因翻译，在转录后水平调节基因表达。自1993年被首次报道以来，已有上千条miRNA在哺乳动物中被发现，但其中绝大部分功能未明。研究发现，miRNA广泛参与到基因表达、细胞发育、信号转导、炎症应答、肿瘤发生等多种生命过程中。近年来，关于miRNA在自身免疫性疾病及肿瘤研究中的报道屡见不鲜。然而，对于结核这样一种古老而又严重危害人类健康的传染性疾病，miRNA在其中发挥的作用我们却知之甚少。miR-146a是第一个被认为对免疫系统具有调节作用的miRNA，其功能十分强大。大量研究显示，miR-146a广泛参与了多种炎症及自身免疫性疾病等免疫反应相关疾病的发生过程。有研究报道miR-146a基因多态性与结核病易感性相关，然而，关于miR-146a在结核分枝杆菌感染及结核病发病机制中的功能性研究尚无报道。基于以上研究背景，本研究建立了稳定的结核分枝杆菌感染巨噬细胞模型，观察结核分枝杆菌感染后巨噬细胞miR-146a的诱导表达以及巨噬细胞功能变化情况，分析miR-146a在其中发挥的作用及可能的机制，从而为进一步研究结核分枝杆菌在机体内的免疫机制提供一定的理论依据。
　　第一部分 结核分枝杆菌对miR-146a的表达调节
　　为了检测结核分枝杆菌BCG感染是否会导致miR-146a表达水平发生变化，我们首先建立了结核分枝杆菌感染的小鼠模型，并观察了小鼠肺泡巨噬细胞中miR-146a表达的变化情况。结果显示，感染后3天miR-146a即表现出轻微的上调，随着感染时间的延长miR-146a表达逐渐增高，至21天到达峰值，随后出现下降。接下来，我们建立了结核分枝杆菌感染的体外模型，观察了结核分枝杆菌BCG感染RAW264.7细胞6h、12h、24h及36h时miR-146a的动态变化。实时定量PCR结果表明，感染后6hmiR-146a的表达出现上调，至24h时到达顶峰，36h开始下降。此外，为证实miR-146a的诱导表达与BCG感染浓度密切相关，我们采用不同感染复数(MOI，即细菌数∶细胞数)感染细胞，结果表明，miR-146a的诱导表达随BCG感染复数的增加而增加。除RAW264.7细胞外，结核分枝杆菌感染还能诱导小鼠原代腹腔巨噬细胞以及骨髓来源巨噬细胞的miR-146a高表达。这些结果表明，在小鼠体内，结核分枝杆菌可在感染早期上调miR-146a的表达，体外细胞模型提示结核分枝杆菌感染能够以时间依赖及剂量依赖的方式显著上调巨噬细胞内miR-146a的表达。鉴于结核分枝杆菌胞壁含有有多种糖脂成分，这些成分也可能刺激巨噬细胞miR-146a上调表达，我们比较了活的结核分枝杆菌和热灭活结核分枝杆菌作用于巨噬细胞对于miR-146a诱导表达的变化。结果显示，活菌与热灭活菌均可诱导miR-146a上调表达，但上调幅度明显不同，活菌诱导的miR-146a上调表达更加显著。提示结核分枝杆菌分泌蛋白等在miR-146a表达诱导中可能也起到了一定作用。接下来，我们观察了参与miR-146a表达的信号通路，根据与结核分枝杆菌感染有密切关系的信号通路，我们采用相应抑制剂预处理细胞，感染后观察miR-146a表达变化，结果显示，仅NF-kB抑制剂组miR-146a表达明显降低，提示结核分枝杆菌感染诱导的miR-146a上调表达依赖于NF-κB信号通路。
　　第二部分 miR-146a在结核分枝杆菌感染中作用机制研究
　　通过第一部分的研究，我们发现结核分枝杆菌感染可显著诱导巨噬细胞miR-146a的表达。那么，究竟miR-146a在结核分枝杆菌感染中发挥了怎样的作用？我们分别利用化学合成的miR-146a模拟物(miR-146a mimics)和miR-146a抑制剂(miR-146a inhibitor)过表达或下调巨噬细胞内源性miR-146a的水平，以结核分枝杆菌感染巨噬细胞后检测炎性细胞因子及趋化因子的分泌情况。结果显示，与对照组相比，miR-146a模拟物可显著抑制巨噬细胞感染后TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1的mRNA和蛋白水平的表达;与之相反，miR-146a抑制剂却促进了巨噬细胞对结核分枝杆菌感染的炎症应答。以上结果提示:miR-146a可负性调控巨噬细胞对结核分枝杆菌BCG感染所产生的炎症应答。巨噬细胞吞噬病原体后随之活化，并可通过一氧化氮相关途径杀灭胞内病原体，因此我们检测了过表达和抑制巨噬细胞内源性miR-146a后一氧化氮的释放情况以判断巨噬细胞的杀菌功能。结果显示，miR-146a模拟物可显著降低巨噬细胞一氧化氮的释放，而miR-146a抑制剂则可促进一氧化氮的释放。我们同样分别将化学合成的miR-146a模拟物、抑制剂瞬时转染RAW264.7细胞，48小时之后用FITC标记的结核分枝杆菌BCG以20∶1的比例与巨噬细胞共孵育4h，以流式细胞术检测巨噬细胞对BCG的吞噬功能。结果显示，转染了miR-146a mimics的细胞，其吞噬结核分枝杆菌的百分比明显增加，提示miR-146a促进了巨噬细胞对于结核分枝杆菌的吞噬。结核杆菌感染，特别是在感染早期，炎症应答对于结核分枝杆菌的清除十分重要。在明确了miR-146a可以负向调节巨噬细胞对结核分枝杆菌感染的炎症应答后，我们观察了过表达或抑制内源性miR-146a对结核分枝杆菌在巨噬细胞内的增殖情况的影响。菌落计数结果显示，相比较对照组，过表达miR-146a后，结核分枝杆菌在巨噬细胞内的繁殖明显增加。然而，miR-146a抑制剂仅显示了轻微的抑制细菌复制的功能，与对照组相比并无统计学意义。推测可能与时间延长瞬时转染的miR-146a抑制剂功能逐渐丧失有关。
　　第三部分 miR-146a靶向作用于IRAK-1和TRAF-6负向调控炎症反应
　　前已述及，miRNA通过与靶基因3'-UTR互补结合发挥其生物学功能，因此接下来这部分我们主要研究miR-146a是通过哪个或哪些靶基因发挥作用的。我们通过TargetScan(http://www.targetscan.org)、PicTar(http://pictar-mdc-berlin.de)及Miranda (http://www.microrna.org/microrna/home.do)等数据库对miR-146a的靶基因进行了分析和预测，并结合文献报道确定了miR-146a的两个可能靶基因 IRAK-1和TRAF-6作为进一步研究的对象。生物信息学预测显示，IRAK-1和TRAF-6 3'-UTR含有与miR-146a互补的靶序列，因此我们构建了含有IRAK-1和TRAF-6 3'-UTR结合序列的报告基因质粒。双荧光素酶活性实验发现，miR-146a可显著抑制IRAK-1和TRAF-6 3'-UTR结合序列的报告基因质粒的荧光素酶活性。此外，通过荧光定量PCR和免疫印迹western blot的方法对过表达或抑制了miR-146a表达的巨噬细胞进行检测，我们同样发现IRAK-1和TRAF-6的mRNA水平及蛋白水平均受到miR-146a的抑制。接下来，为了验证IRAK-1和TRAF-6在结核分枝杆菌感染诱导的炎症应答中的作用，我们将特异性沉默IRAK-1和TRAF-6的siRNA转染进入巨噬细胞，以结核分枝杆菌感染细胞24小时后检测炎症因子的分泌情况。结果显示，相比对照组，si-IRAK-1和si-TRAF-6组细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1 mRNA水平和蛋白水平显著降低，与过表达miR-146a的结果相似。此外，敲除IRAK-1和TRAF-6之后，结核分枝杆菌在巨噬细胞内的复制明显增加。然而，IRAK-1及TRAF-6对于巨噬细胞的吞噬并无明显作用。由此，我们得出结论，miR-146a可通过抑制IRAK-1和TRAF-6发挥其负向炎症调控作用。综合以上研究，我们发现，结核分枝杆菌BCG感染巨噬细胞后可显著上调miR-146a的表达;miR-146a在巨噬细胞对结核分枝杆菌感染的炎症应答过程中发挥重要的负调控作用，可减少促炎因子的分泌及杀菌物质的释放并增强巨噬细胞对结核分枝杆菌的吞噬，进而促进结核分枝杆菌在巨噬细胞内的生存和繁殖;miR-146a对结核分枝杆菌感染导致炎症的负性调控作用是通过抑制IRAK-1和TRAF-6的表达实现的。

目录

缩略词表

摘要

前言

第一部分 结核分枝杆菌对miR-146a表达的调节

材料和方法

结果

讨论

第二部分 miR-146a在结核分枝杆菌感染中的功能研究

一、材料方法

结果

讨论

第三部分 miR-146a靶向作用于IRAK-1和TRAF-6负向调控炎症反应

一、材料方法

二、实验方法

讨论

小结

参考文献

基本情况

学位课程成绩

在读期间发表相关论文及综述

致谢

综述 microRNA-146a研究进展

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