利用转基因鼠研究基因Atoh1/Math1介导的前庭毛细胞再生

摘要

目的：体外研究表明在大鼠椭圆囊上皮内过量表达基因Atoh1/Math1可以诱导产生新的毛细胞，但相关在体动物研究尚无明确结论。本研究利用转基因小鼠建立了可在特定时点于前庭上皮内过量表达基因Atoh1/Math1的动物模型，拟应用该动物模型进行相关研究以回答如下问题：1.过量表达基因Atoh1/Math1能否在体内实验中诱导产生新的前庭毛细胞；2.在前庭上皮内什么类型的细胞具有在基因Atoh1/Math1诱导下转化为毛细胞的能力；3.这种可转化为毛细胞的能力是否随着组织发育的不断成熟而逐渐消失；4.除了促进细胞分化以外，Atoh1/Math1的过量表达是否具有促进细胞分裂增殖的作用；5.能否通过调节其他信号通路诱导产生新生的毛细胞。
　　 方法：本研究使用了在强力霉素诱导下能够定时定位表达外源性Atoh1/Math1基因的转基因小鼠模型。在该型小鼠体内，Foxg1基因使Cre重组酶特异性的表达于小鼠内耳上皮；在该组织内，Cre重组酶能切除rtTA基因上游的终止框，使rtTA基因表达。若同时在特定的时点用含有强力霉素的食物饲喂小鼠，则rtTA和强力霉素结合共同作用于外源性Atoh1/Math1基因上游的TRE，启动Atoh1/Math1基因的表达。本研究首先通过在小鼠生后不同的时点用含有强力霉素的食物和饮水饲喂小鼠，诱导其体内的Atoh1/Math1基因表达，观察过量表达Atoh1/Math1基因在不同时点对小鼠椭圆囊感觉上皮发育的影响，判定是否有新的毛细胞产生。然后，本研究在用强力霉素诱导Atoh1/Math1大量表达的同时，对小鼠皮下注射Brdu，通过对Brdu进行染色，观察在Atoh1/Math1介导的在体前庭毛细胞再生过程中有无细胞分裂和增殖现象。最后，本实验通过体外培养技术，通过药物抑制Notch、FGF和BMP等信号通路，研究了抑制这些信号通路对毛细胞再生效应的有关作用。
　　 结果：逆转录半定量PCR表明，在强力霉素诱导下，基因型为pTM+，foxglcre+，rtTA+的阳性小鼠椭圆囊上皮Atoh1/Math1基因的mRNA水平要显著高于基因型为pTM-，foxglcre+，rtTA+的阴性对照小鼠。在本实验所涉及的最后时点生后第21天，利用Atoh1/Math1-GFP基因作为报告基因，本研究发现在基因型为pTM+，foxglere+，rtTA+的阳性小鼠椭圆囊上皮内，GFP信号不仅存在于毛细胞层，而且大量表达于支持细胞层。而在基因型为pTM-，foxglcre+，rtTA+的阴性小鼠椭圆囊上皮中，GFP仅较多的存在于毛细胞层，在支持细胞层只有个别细胞表达GFP。该结果表明在出生后第21天，仍可在阳性动物体内诱导Atoh1/Math1基因在蛋白水平的过量表达。本实验研究了P0，P7，P14和P21四个时点在小鼠体内过量表达Atoh1/Math1对小鼠椭圆囊感觉上皮发育造成的影响，结果表明在新生小鼠的椭圆囊上皮内过量表达Atoh1/Math1可在微纹区及其附近和非感觉区诱导产生新的毛细胞，随着生后天数的不断延长，产生的新生毛细胞逐渐减少。在P7阶段已无法在非感觉区诱导产生新的毛细胞，在P21阶段，则无法在微纹区及其附近诱导产生新的毛细胞。通过对小鼠皮下注射Brdu并行染色，本研究对Atoh1/Math1介导的前庭毛细胞在体再生过程中的分裂增殖变化进行了分析，结果表明在过量表达Atoh1/Math1的情况下，新生小鼠椭圆囊感觉上皮存在着活跃的有丝分裂活动，并且部分新生毛细胞为Brdu染色阳性；细胞分裂增殖现象存在于整个椭圆囊上皮，尤以微纹区及其附近最为显著。最后，在体外培养实验中，本研究发现通过药物抑制Notch和FGF信号通路能够增加椭圆囊感觉上皮内表达Atoh1/Math1的细胞数量，并在椭圆囊微纹区诱导产生新生的毛细胞，而抑制BMP信号通路则无法诱导产生新生的毛细胞。
　　 结论：过量表达Atoh1/Math1基因可以在小鼠体内诱导产生新的前庭毛细胞；在椭圆囊上皮内位于微纹区及其附近的支持细胞和位于非感觉区的细胞具有在Atoh1/Math1作用下转化为毛细胞的能力；这些转化为毛细胞的能力随着生后时间的不断延长逐渐消失；在小鼠产生新的前庭毛细胞的过程中，Atoh1/Math1基因在一些时点具有促进细胞分裂增殖的作用，部分新生的毛细胞为分裂增殖的子细胞发育而来；抑制Notch和FGF信号通路能够上调Atoh1/Math1的表达水平并在椭圆囊微纹区诱导产生新生的毛细胞。