现代分离分析技术在板蓝根成分分析中的应用研究

摘要

本论文针对板蓝根及其有效成分展开了一系列药物分析学方面的研究。采用现代分离分析技术依次建立和发展了板蓝根脂溶性部位、板蓝根水溶性部位、板蓝根氨基酸、板蓝根多糖、板蓝根挥发性成分以及板蓝根药材的分析手段，试探性地提出了新的分析理论或者方法，探索出了针对板蓝根不同性质目标组分的合理定性定量研究途径。在样品前处理和样品分析技术两个方面引入了一些新方法新技术，对一些现行方法进行了改进，拓宽了这些方法的应用领域，也获得了一系列创新性的研究成果。本论文的主要研究如下：
　　 第一章，我们依次从板蓝根的化学成分、板蓝根的药理作用和临床应用、板蓝根的提取方法、板蓝根的分析技术，比较全面地概述了板蓝根的研究现状。板蓝根的现行分析手段不能很好地解决中药板蓝根质量控制方面存在的问题，更不用提及板蓝根制剂的分析研究以及该药物的临床用药安全性等方面。因此，针对板蓝根药材及其活性成分，采用现代分离分析技术，开展系统性研究是十分必要的。本课题研究也正是在这样的时代要求下开始此次研究。
　　 第二章，以板蓝根脂溶性部位活性成分为研究对象，开展了以下几个方面的研究：1)建立了红外光辅助提取法(IRAE)结合响应面优化法(RSM)优化提取色胺酮、靛蓝和靛玉红的条件，确定了红外光辅助提取的最佳条件。红外光辅助提取法较传统提取方法而言，十分经济、方便、有效、而且不限制提取溶剂种类，表现出良好的提取效率。2)首次建立了11个产地板蓝根脂溶性部位的改良多波长组合指纹图谱，拟合出24个共有峰的参照指纹色谱图，并确定了其中7个色谱峰。不同产地板蓝根的分层群聚分析(HcA)和主成份分析(PCA)结果表明采收时期和耕种地理位置对板蓝根药材质量都存在影响。3)首次建立了基于苯甲酸一测多评和各组分最佳检测波长液相色谱技术(Benzoic acid-based QAMS/RODWs-HPLC)，该方法能够克服传统色谱分析依赖多种对照标准品展开定性定量分析、检测器灵敏度较低等缺点。将单一对照品苯甲酸作为参照，借助基于苯甲酸的相对保留时间、相对校正因子，运用各组分最佳检测波长液相色谱法在230，236，245和275 nm紫外检测波长下，有选择地、较高灵敏度地分析待测样品中的乙酰水杨酸，苯甲酸，水杨酸，邻氨基苯甲酸和丁香酸。通过建立相应网络数据库，充分地利用和挖掘Benzoic acid-based QAMS/RODWs-HPLC方法。4)我们课题组开发了智能在线固相萃取与多级柱切换，基于苯甲酸一测多评和各组分最佳检测波长液相色谱联用技术(Automated on-line SPE/Multi-stagecolumn-switching and Benzoic acid-based QAMS/RODws-HPLC)，该联用技术是一种新颖的、有效的分析血浆样品中丁香酸，苯甲酸和水杨酸的方法。这些研究成果分别发表在Journal of Separation Science(2011，34，1123-1132.)、ActaChromatographica(In Press)、Chromatographia(In Press)杂志。
　　 第三章，以板蓝根水溶性部位活性成分为研究对象，开展了以下几个方面的研究：1)我们首先引入红外光辅助提取技术(IRAE)这一新颖的前处理技术分析板蓝根药材中腺苷，确定了最优前处理条件：260W红外光功率，45min红外光辐射时间，1:20固液比和40％N乙醇水溶液浓度。同时建立了一种针对板蓝根中腺苷的简单液相色谱法。红外光辅助提取技术是一种简单、快速、环保、低成本的提取分离方法，在中药质量控制中具有比较好的应用前景。2)我们运用ESI-MS质谱法，系统研究了板蓝根水溶性部位化合物成分，最终确定了该部位中胞苷，尿苷，鸟苷，(R，S)-告依春和腺苷五个主要水溶性化合物。3)首次建立这些化合物的各组分最佳检测波长液相色谱分析方法，结合优化的微波辅助提取法(400W微波功率，1:80固液比和10min辐射时间)对板蓝根水提取中五种主要化合物进行定量分析。各组分最佳检测波长液相色谱(RODWs-HPLC)表现出非常宽的线性浓度范围，很好的灵敏度和比较直观的三维立体效果。这些研究成果分别发表在Chromatographia(2010，72，719-724.)、Journal of the Chinese Chemical Society(2012，59，51-59.)杂志。
　　 第四章，建立了一种简单、实用的分析20种常见氨基酸的9-氯甲酸芴甲酯(FMOC-C1)柱前衍生化液相分析方法，确定了20种氨基酸的线性回归方程，达到几十纳克级的检测限。首次将该方法运用到不同产地板蓝根氨基酸的分析中，结果：板蓝根氨基酸主要是脯氨酸(Pro)、精氨酸(Arg)、蛋氨酸(Met)和缬氨酸(Val)，11个产地板蓝根含有四种氨基酸的总量为13.32～19.16 mg/g(板蓝根生药)。拟合出标准化板蓝根氨基酸的9-氯甲酸芴甲酯柱前衍生化色谱图。该研究成果发表在Journal of the Chinese Chemical Society(2011，58，509-515.)杂志。
　　 第五章，采用了微波辅助提取，PMP柱前衍生化法分析了板蓝根多糖。建立了一种PMP柱前衍生高效液相色谱法分析板蓝根多糖所含单糖的方法，其准确可靠，灵敏度较高，取样量少，且分离效果理想，适用于板蓝根多糖样品的测定。由本法测定的板蓝根多糖结果显示，板蓝根多糖中主要是D-葡萄糖、L-鼠李糖和D-半乳糖组成。该研究成果发表在时珍国医国药(2012，23(1)：236-237.)杂志。
　　 第六章，借助水蒸汽蒸馏法提取板蓝根挥发性成分，GC-MS联用和NIST2008版质谱数据库对板蓝根挥发性成分进行分析，筛选出20个色谱峰，初步确定了其中的17个化合物。安徽产板蓝根中含有十六酸甲酯(Hexadecanoicacid Methyl ester)、9，12，15-十八碳三烯酸甲酯((Z，Z，Z)-9，12，15-Octadecatrienoicacid Methyl ester)的比例最大。首次在板蓝根挥发性成分中发现：邻苯二甲酸二乙酯(Diethyl Phthalate)、邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate)、二十烷醇(1-Eicosanol)、十七烷醇(n-Heptadecanol-1)和9-十六碳烯酸甲酯((Z)-9-Hexadecenoic acid Methyl ester)。结果说明不同产地因素对板蓝根挥发性成分的含量和化合物种类都有明显的影响。
　　 第七章，采用最新的傅里叶变换红外一衰减全反射技术(ATR-FTIR)对板蓝根药材展开了整体质量分析。通过坐标转换、背景扣除、平滑、基线校正和归一化处理后，首次建立了11个产地板蓝根药材的波数(ν，cm-1)--吸光率(A)中红外光谱图。依据相似度的夹角余弦法计算公式，得到了11个产地板蓝根药材之间中红外光谱相似度值。对比板蓝根主要化合物、板蓝根提取部位和板蓝根药材之间谱图，认为板蓝根药材主要含有水溶性成分，这其中包括有板蓝根多糖。板蓝根的良好临床疗效主要来源于板蓝根水溶性成分。
　　 总之，本论文针对板蓝根及其有效成分的样品前处理和样品分析技术这两大热点难点问题，发展了相关高提取率、快速便捷的新样品前处理方法，并进行实际板蓝根样品和有效成分的生物样品的方法应用。结合现代色谱光谱分析手段，提出了一些新颖性的分析检测技术。通过这一系列的研究成果，为科学合理地开发利用板蓝根药材资源提供了现实的、有效的、借鉴性的评价方法。