EphB/ephrinB反向信号在慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞损伤中的作用及其机制研究

摘要

青光眼是一类常见的致盲性眼症，以视神经乳头病变、神经节细胞数目减少和视野缺失为特征，眼内压增高是其最重要的致病因素之一。青光眼引起的视网膜神经节细胞损伤是其导致不可逆性视功能损害的根本原因。目前，临床治疗青光眼的主要手段是降低眼内压，在有效地降低眼内压的基础上，针对青光眼具有慢性退行性疾病的特点，利用钙通道阻断剂、NMDA受体拮抗剂、抗氧化剂、NO合酶抑制剂和神经营养因子等，从不同环节发挥神经保护作用。然而，与其它慢性神经退行性疾病相似，青光眼视网膜神经节细胞损伤的确切机制还不十分清楚。
　　促红细胞生成素产生肝细胞受体(erythropoietin-producing hepatocyte receptor，Eph)是目前已知最大的受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)家族之一，包含16个结构上相关的跨膜酪氨酸激酶。Eph受体及其配体广泛分布于机体各种组织，同时具有广泛的生理功能，包括调节肌动蛋白细胞骨架、细胞粘附、运动、细胞存活、增殖、分化和分泌等。近年来有研究结果提示，ephrin/Eph信号在青光眼的进程中有着重要作用，且ephrinB反向信号在神经节细胞轴突的瞬时增加提示其参与神经节细胞轴突的损害。但是，其中的机制目前尚未完全阐明，而且不同的实验室报道在不同的青光眼模型中发生变化的ephrin/Eph亚型也不一样，这种结果的不一致性究竟是由于抗体的选择不同还是实验对象种属不同又或者是所采取的青光眼不同模型对视网膜或视神经损伤程度不同现在也不得而知。
　　在本课题中，我们利用免疫组织化学、Western blot、免疫共沉淀和膜片钳电生理等技术，研究了慢性眼内压增高大鼠视网膜EphB1，EphB2，ephrinB1和ephrinB2的分布及表达量的变化，以及EphB/ephrinB反向信号的激活参与慢性眼内压增高大鼠视网膜神经节细胞损伤的可能机制。主要结果如下:(1)采用大鼠巩膜上静脉结扎的方法，成功地制备了大鼠慢性高眼压模型;(2)利用免疫组织化学和Western blot等方法，我们发现在慢性高眼压的大鼠视网膜EphB1和ephrinB2蛋白表达明显增强，而EphB2和ephrinB1没有显著变化。EphB1蛋白表达在手术后1天(1d)即明显升高，3d达到高峰，并且在手术后1周(1w)至6w都维持在较高水平，增加的部位主要在Müller细胞上;ephrinB2蛋白表达在眼内压增高2w明显增加，在此后我们观察的6w时间内都维持较高水平，增加的部位在视网膜Müller和神经节细胞;而EphB2在神经节细胞层和内核层都有表达，但在眼内压增高后的各个观察时间点其表达量没有显著性变化;ephrinB1在正常视网膜表达较低，且手术后表达没有明显的变化。(3)利用特异的ephrinB酪氨酸磷酸化抗体经Western blot检测到ephrinB磷酸化在眼内压增高第3d即开始明显升高，一直持续到6w，表明ephrinB反向信号的激活。(4)为了确认慢性眼高压大鼠视网膜中激活的ephrinB反向信号的作用，我们在正常大鼠玻璃体内注射激活反向信号的受体可溶性片断EphB2-Fc，然后检测视网膜铺片上神经节细胞的TUNEL阳性信号，结果发现，与注射空白对照的片断相比，EphB2-Fc注射组的TUNEL阳性信号明显增多。此结果提示EphB/ephrinB反向信号的激活可能参与大鼠视网膜神经节细胞的损伤。(5)在反向信号引起大鼠视网膜神经节细胞凋亡增多的机制研究中，利用免疫共沉淀的方法，我们发现ephrinB2可以与酪氨酸激酶家族中的src和AMPA受体的GluR2亚基相互作用，提示反向信号的激活可能通过src酪氨酸激酶调节GluR2的功能。（6）玻璃体内注射EphB2-Fc引起正常大鼠视网膜ephrinB磷酸化增加的同时，src和GluR2的酪氨酸磷酸化均增强，而且在慢性眼高压大鼠视网膜也观察到了src和GluR2的磷酸化也升高。（7）免疫组织化学和膜蛋白免疫印迹等一列实验结果显示，GluR2酪氨酸磷酸化的增加使神经节细胞膜上GluR2含量下降。EphB2-Fc注射组的大鼠视网膜神经节细胞膜上GluR2较对照组视网膜明显减少，慢性眼高压2w的大鼠视网膜上GluR2表现同样的变化。通过全细胞膜片钳技术，在EphB2-Fc注射组的视网膜切片上记录到电刺激诱发的AMPA受体介导的兴奋性突触后电流(eEPSCs)出现明显的内向整流特性。(8)用src特异性的抑制剂PP2预先玻璃体注射，随后再行慢性高眼压手术或EphB2-Fc注射，Western blot检测发现，PP2在抑制src活性的同时也抑制了GluR2的酪氨酸磷酸化，免疫组织化学结果显示PP2抑制视网膜神经节细胞膜上GluR2含量的下降，更重要的是凋亡检测结果发现，PP2可以抑制由ephrinB反向信号激活导致的神经节细胞的凋亡。
　　综上所述，在我们制作的大鼠慢性高眼压模型上发现，EphB1和ephrinB2蛋白表达在视网膜明显增多，EphB1的变化主要发生在Müller细胞，而ephrinB2在Müller细胞和神经节细胞上，且EphB1的升高早于ephrinB2，提示神经节细胞EphB/ephrinB反向信号的激活。玻璃体内注射EphB2-Fc激活EphB/ephrinB反向信号导致正常大鼠视网膜神经节细胞的凋亡，其机制是通过src酪氨酸激酶途径使GluR2磷酸化，进而使神经节细胞膜上含有GluR2亚单位的AMPA受体数量减少，钙通透性增加。而玻璃体内注射src酪氨酸激酶抑制剂PP2可以通过抑制GluR2磷酸化，逆转神经节细胞膜上GluR2的减少，从而减弱由注射EphB2-Fc和高眼压引起的神经节细胞凋亡。这些结果提示，EphB/ephrinB反向信号的激活参与慢性高眼压视网膜神经节细胞的损伤，干预这一信号通路可能成为治疗青光眼神经节细胞凋亡的靶点。

目录

缩略语及符号

摘要

引言

材料和方法

1．慢性高眼压大鼠模型的制备

2．眼压的测定

3．玻璃体腔显微注射

4．视网膜神经节细胞的上丘逆行追踪标记

5．液体配制

6．免疫荧光组织化学

7．蛋白免疫印迹(Western blot)检测

8．免疫共沉淀(Co-IP)

9．TUNEL染色检测细胞凋亡

10．全细胞膜片钳记录电刺激诱发的AMPA电流

11．数据处理及统计分析

实验结果

1．慢性眼高压模型大鼠在不同时间点的眼压变化

2．EphB1、EphB2和ephrinB1、ephrinB2在慢性高眼压模型大鼠视网膜中的表达变化

3．实验性青光眼大鼠视网膜中ephrinB反向信号激活

4．玻璃体内注射EphB2-Fc激活ephrinB反向信号途径引起视网膜神经节细胞凋亡

5．ephrinB反向信号增强引起视网膜神经节细胞凋亡的机制

讨论

总结

参考文献

综述 ephrin／Eph信号系统的生理功能和在疾病发生中的作用

学习期间完成的论文和摘要

致谢

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