促进视网膜神经节细胞轴突生长的中药筛选研究

摘要

目的:青光眼、视神经炎以及其他一些眼科疾病的一个共同病理特征是视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGCs)的不可逆性凋亡及其神经轴突的变性消亡，探寻促进RGCs轴突再生的方法可以使这类疾病的治疗易于实现。中医药因疗效确切、副反应少等特点，近年来在视神经再生领域日渐被人们所重视，成为视神经再生手段的有益补充。本研究将对可能促进RGCs轴突生长的中药单体或提取物进行筛选，寻找有效的中药成分，并对其促轴突生长的作用机制进行探讨。
　　方法:采用三维立体培养系统进行视网膜植片培养，给予不同药物后，相差显微镜下观察RGCs轴突数量和长度的变化，筛选出有效促进RGCs轴突生长的药物。对于筛选出的药物，再进行视网膜植片培养，根据轴突数量和长度的变化明确药物的最佳作用浓度。在RGCs轴突再生最佳的时点进行轴突免疫共标染色，明确观察到的神经突起为RGCs的轴突。培养的视网膜植片在不同时点制备冰冻切片，进行TUNEL染色检测视网膜神经节细胞层(GCL)细胞的凋亡，进行免疫荧光染色观察Caspase-3的激活情况。将不同时点的视网膜植片进行Western blot蛋白检测，观察PKC-α的活化情况。最后给予PKC抑制剂，观察干预后RGCs轴突的生长效果。
　　结果:视网膜植片在培养1～2天开始出现神经突起，在第6天达到最多，各药物组和对照组均有不同数量和长度的神经突起产生，但银杏内酯B和野黄芩苷两组的轴突数量和长度明显高于阴性对照组。银杏内酯B的最佳作用浓度是2mg/L，而野黄芩苷的最佳作用浓度是50μmol/L。相差显微镜下所观察到的神经突起能够被GAP-43和Thyl.l或β-tubulinⅢ共标染色，说明所观察的神经突起为RGCs的轴突。与阴性对照组相比，银杏内酯B和野黄芩苷均能减少GCL中细胞的凋亡，抑制Caspase-3的活化。Western blot蛋白检测发现在轴突生长过程中，PKC-α活化增加，而野黄芩苷增加了PKC-α的活化，在给予PKC抑制剂后野黄芩苷的促轴突生长作用也被抑制。
　　结论:通过药物筛选发现银杏内酯B和野黄芩苷两种中药有效成分具有促进RGCs轴突生长作用，并有一定的神经保护作用，野黄芩苷的促轴突生长作用主要是通过活化PKC-α实现的。

目录

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摘要

引言

一、材料和方法

1．1 动物、试剂和伦理

1．2 建立视网膜植片立体培养系统

1．3 形态学观察和测量

1．4 植片免疫荧光染色

1．5 TUNEL染色

1．6 Caspase-3免疫荧光染色

1．7 Western blot蛋白检测

1．8 数据统计与分析

二、实验结果

2．1 RGCs轴突生长趋势及药物筛选结果

2．2 银杏叶提取物和银杏内酯B的促轴突生长作用

2．3 免疫荧光染色验证RGCs轴突

2．4 银杏内酯B对RGCs的抗凋亡作用

2．5 野黄芩苷的促轴突生长作用

2．6 野黄芩苷对RGCs的抗凋亡作用

2．7 野黄芩苷促轴突生长过程中PKC-α的作用

三、讨论

四、结论

参考文献

附录一：综述 关注视神经损伤性疾病 促进视神经再生研究

附录二：硕士阶段发表论文

致谢

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