糖尿病引起的小鼠视网膜神经节细胞生理活动的变化

摘要

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种由高血糖症(hyperglycemia)造成的常见疾病，其发病率在发达国家和发展中国家均呈升高趋势。糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)，或称糖网病，是糖尿病的常见并发症之一，可引起视觉功能的减退，甚至导致失明。DR不仅损伤视网膜的血管系统，还可破坏视网膜神经系统。虽然已有大量研究报道糖尿病患者和糖尿病模型动物的视网膜神经元受损及发生退行性的病变，然而，对于视网膜神经元的功能在糖尿病状态下所产生的变化及其生理机制，目前仍不清楚。这是对DR的治疗和预防尚缺乏有效手段的重要原因之一。
　　视网膜神经节细胞（ganglion cell，GC）是视网膜中的第三级神经元，也是视网膜唯一的输出神经元。它们接收并整合来自各种上级神经元的视觉信号，包括双极细胞的兴奋性输入，以及无长突细胞的抑制性输入;对这些信号进行初步加工后，以动作电位的形式向高级视觉中枢传递。所以，GC在视网膜信号处理过程中扮演重要角色，其功能异常往往导致严重的视觉疾病。GC位于视网膜表面，易于观察、记录，近年来对其研究不断取得进展，但在单细胞层次研究糖尿病影响GC功能的工作非常罕见。在本研究中，我们通过在单细胞水平，大样本分析糖尿病动物GC的电生理活动，探索视网膜神经环路在糖尿病状态下的变化。
　　在本工作中，我们采用STZ诱导产生Ⅰ型糖尿病的C57小鼠作为动物模型，在糖尿病发病3～4个月时，观察了暗适应状态下视网膜铺片标本中GC的生理活动，包括GC的对光反应和自发放电活动;并使用细胞染色和计数技术，观察了视网膜神经元凋亡的情况。
　　小鼠经腹腔注射STZ后，血糖值显著上升并保持在高水平，且体重的变化以及多饮多尿的特点均符合Ⅰ型糖尿病的特征，表明我们所建立的动物疾病模型有效、可靠。在成功诱导高血糖症3～4个月后，我们采用非紧密封接的细胞贴附式膜片钳记录(即loose-patch)法，在暗适应后的小鼠视网膜铺片标本上，对GC进行记录。
　　在接受光刺激后，正常视网膜中的绝大多数GC可产生ON型和/或OFF型光反应，根据以上反应极性，可将GC分为ON-GC、OFF-GC和ON-OFF-GC这三种基本的生理学亚型。我们观察到，在糖尿病情况下，有相当一部分GC失去了对光反应能力。这一现象初步提示，糖尿病影响了GC的基本生理反应，这可能导致视觉功能的损伤。
　　本工作的主要研究对象，是小鼠视网膜GC在暗中的自发动作电位发放（即自发放电）情况。我们对各亚型GC的自发放电活动进行连续的loose-patch记录，待细胞状态稳定后，取时长为1分钟的数据进行统计分析。我们观察到，GC的自发放电频率在不同神经元之间差异很大;对三个亚类的GC分别进行统计，发现ON-和OFF-GC的自发放电频率分布均呈现非正态分布的特征。STZ诱导产生糖尿病3个月后，ON-GC的自发放电频率显著高于对照组，且成簇发放(burst)增多，表现为成簇发放的频率，及其所占时间在细胞总的活动时间中的比例均显著增高。我们所记录到的OFF-和ON-OFF-GC的数目远比ON-GC要少，在现有的样本量基础上进行的分析显示，它们的自发放电频率在糖尿病组和对照组间均没有差异。
　　我们进而使用药理学手段，进一步探讨糖尿病动物ON-GC自发放电增强的可能机制。在暗中，当使用突触阻断剂混合物阻断视网膜内主要的化学突触传递后，正常小鼠视网膜ON-GC的自发放电活动能够被完全压抑，表明这种活动是完全依赖于突触输入的。在糖尿病中，大部分ON-GC保持这种生理特性，而有一部分的ON-GC出现了突触输入非依赖的自发放电活动。提示糖尿病可能改变了一部分ON-GC的内源性电生理特性。
　　GABA受体和甘氨酸受体介导视网膜内主要的抑制性信号传递。在Ringer's液中施加以上两种受体的拮抗剂，阻断对ON-GC的抑制性输入后，糖尿病组和对照组ON-GC的自发放电频率均出现升高，且升高后的放电频率在两组之间没有统计学上的差异。该结果与正常Ringer's液中糖尿病组ON-GC的自发放电频率显著高于对照组的现象相结合，提示在糖尿病状态下，上级神经元对ON-GC的抑制性输入是减弱的，这可能是造成ON-GC自发活动增多的主要机制之一;另一方面，该结果也提示，暗适应中的ON-GC所接受的兴奋性输入，在糖尿病状态下并未发生改变。
　　我们对小鼠全视网膜铺片进行TUNEL标记，并使用DAPI复染来确认视网膜神经元的位置，以排除TUNEL检测时假阳性信号的干扰。使用Neurolucida系统统计TUNEL信号的结果显示，与对照组相比，糖尿病3个月时，单位面积视网膜中的TUNEL阳性信号总数没有显著变化。此结果提示，在我们的动物模型所处的糖尿病早期阶段，视网膜神经元的凋亡水平尚未受到明显影响。
　　综上所述，我们得到的结论是:在STZ诱导的糖尿病发病3个月时，虽然小鼠视网膜神经元未发生大规模的凋亡，然而此时GC的生理功能已经受到了显著的影响，这些影响包括:GC对光反应能力的丢失、ON-GC自发活动水平的增高、内源性电生理特性可能发生的改变以及其所接受的抑制性突触输入的减弱等。这些发现将为我们进一步认识早期糖尿病时，视网膜神经元生理功能的变化及其机制提供重要信息，并可能为寻找治疗、控制糖尿病视网膜病变的潜在靶点提供有益的参考。

目录

缩略语及符号

摘要

一、引言

二、材料和方法

1 糖尿病动物模型的建立

2 小鼠视网膜铺片的电生理记录

2．1 小鼠全视网膜铺片(whole-mount retina)的制备

2．2 成像系统

2．3 记录系统

2．4 工具药

2．5 光刺激

3 使用TUNEL方法原位检测DNA片段

4 数据分析

三、实验结果

1 糖尿病小鼠模型的确认

2 糖尿病小鼠视网膜中不感光的GC数日增多

3 正常小鼠视网膜GC的自发放电的特点

4 糖尿病小鼠ON-GC自发放电活动的增多

5 糖尿病弓I起一部分小鼠ON-GC产生内源性放电活动

6 糖尿病压抑小鼠ON-GC的抑制性突触输入

7 糖尿病小鼠视网膜的TUNEL检测(本实验与王璐老师合作完成)

四、讨论

1 糖尿病早期视网膜GC功能的变化

2 糖尿病视网膜ON-GC功能变化的突触机制

3 糖尿病造成视网膜GC功能的变化与视觉功能异常的关系

五、总结

参考文献

综述 糖尿病视网膜神经退行性病变的机制

学习期间完成的论文和摘要

致谢

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