天然小分子化合物对神经退行性疾病相关蛋白异常聚集及神经毒性的干预作用

摘要

阿尔兹海默病和帕金森病严重威害人类健康。人们研究它们的发病机理发现，它们分别与β淀粉样(Aβ)多肽和α突触核(AS)蛋白的错误折叠和聚集密切相关。由于错误折叠和聚集，这些蛋白从正常生理状态下可溶性单体聚集成致病的可溶性的毒性聚集体和不可溶性淀粉样纤维，伴随着组织损伤和疾病的产生。因此，人们开始尝试从新的角度分析、研究和治疗AD，例如寻找可抑制寡聚体生成的化合物，或将已形成的纤维解聚成无毒性的聚集体而非有毒性的纤维前体。然而，目前关于这类化合物的研究报导尚不充分，这些化合物的作用机理仍不清楚。
　　近年研究发现，金属离子能引发Aβ多肽和AS蛋白构象转变，诱导它们形成毒性聚集体。我们设想:可寻找有效的金属离子络合剂，通过其对金属离子的捕捉作用，抑制金属离子与蛋白的相互作用，减少金属离子诱导蛋白纤维化聚集和神经毒性。
　　尽管对于神经退性疾病的治疗目前尚无临床根治性药物，但一些天然小分子化合物因潜在用于治疗此类疾病而被重视。在这些天然小分子化合物中，姜黄素可以与金属离子和神经退行性疾病相关蛋白发生相互作用。然而，目前关于姜黄素与金属离子共同干预下对Aβ多肽和AS蛋白的纤维化和神经毒性的影响报导甚少。此外，海藻糖因显著抑制Aβ多肽聚集引起了重点关注。基于AS蛋白与Aβ多肽纤维化动力学机理的相似性，我们推测海藻糖亦可能抑制AS蛋白的聚集而可能潜在地用于治疗PD。
　　本文试图通过研究姜黄素对金属离子诱导的蛋白聚集和神经毒性的干预作用以及海藻糖对AS蛋白聚集和神经毒性的影响，探索这些小分子化合物在神经退行性疾病中的预防与治疗作用机理，为开发它们为治疗神经退行性疾病新药提供理论基础。本文的主要发现如下:
　　(1)姜黄素对铝(Ⅲ)离子和铁(Ⅲ)离子诱导丝素蛋白构象转变的干预作用
　　基于丝素蛋白与神经退行性疾病相关蛋白的相似性，我们采用丝素蛋白为模型蛋白，研究姜黄素对铁离子和铝离子诱导的蛋白构象转变的影响。研究发现，铁离子和铝离子均能明显促进丝素蛋白构象向β-折叠转变;姜黄素因对金属离子具有强络合能力，而抑制金属离子诱导丝素蛋白构象向β-折叠转变的作用。有意义的是，本章研究进一步发现，当[Al(Ⅲ)]/[curcumin]混合比介于1∶1至1∶2时，形成的Al(Ⅲ)-curcumin络合物，不仅可以有效抑制丝素蛋白β-折叠的形成，而且可将已形成的β-折叠构象解折叠成无规卷曲构象。
　　(2)姜黄素对铝(Ⅲ)离子诱导Aβ42多肽聚集及神经毒性的抑制作用
　　铝(Ⅲ)能明显促进Aβ42多肽纤维化，增加Aβ42多肽的神经毒性，而姜黄素能抑制此过程。此外，姜黄素因对金属离子具有强络合能力，不仅可抑制金属离子诱导Aβ42纤维化作用，而且形成的铝(Ⅲ)-姜黄素络合物可将已形成的Aβ42纤维解聚集成低毒性的无定形聚集体。
　　(3)海藻糖对野生型和A53T突变型α-突触核蛋白纤维化聚集的干预作用
　　海藻糖与野生型AS蛋白共孵育时，在孵育前期，海藻糖诱导形成较大的野生型AS无定形聚集体，在孵育后期，这些预形成的较大无定形聚集体被解聚成小的非折叠态的无定形聚集体甚至单体。此外，当存在低浓度海藻糖干预时，海藻糖虽不能有效抑制A53T突变型AS原纤维的形成，但在孵育后期可将已形成的A53T突变型AS原纤维解聚集成可溶性的非折叠态聚集体甚至单体。当存在高浓度海藻糖干预时，海藻糖通过稳定A53T-AS寡聚体和原丝结构，显著抑制A53T-AS纤维的形成。
　　(4)海藻糖和姜黄素干预野生型和A53T突变型α-突触核蛋白在转基因PC12细胞模型中的过表达和细胞毒性
　　浓度低于1 mM的海藻糖以及姜黄素与铝以1∶1混合时生成的络合物，能明显抑制野生型AS和A53T突变型AS蛋白在转基因PC12细胞内的过表达，且能抑制野生型AS和A53T突变型AS在细胞内的毒性，提高细胞活力。此外，姜黄素与铝以1∶1混合时，生成的络合物，能明显抑制双氧水和铝离子诱导的AS过表达和神经毒性。
　　本文研究表明，铝(Ⅲ)-姜黄素络合物和海藻糖可能是潜在的神经退行疾病治疗药物，值得进一步研究和证实。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 阿尔茨海默病

1．1．1 阿尔茨海默病概述

1．1．2 阿尔茨海默病的临床和病理学特征

1．1．3 阿尔茨海默病的发病机制

1．1．4 阿尔茨海默病治疗现状

1．1．5 阿尔茨海默病治疗存在的困难和展望

1．2 帕金森病

1．2．1 帕金森病概述

1．2．2 帕金森病的临床和病理学特征

1．2．3 帕金森病的发病机制

1．2．4 帕金森病的治疗现状

1．2．5 帕金森病治疗存在的困难和展望

1．3 丝素蛋白

1．4 丝素蛋白、Aβ多肽和AS蛋白的相似性

1．5 本课题的研究意义与内容

参考文献

第二章 姜黄素对铝(Ⅲ)离子和铁(Ⅲ)离子诱导丝素蛋白构象转变的干预作用

2．1 引言

2．2 样品的制备和表征

2．2．1 样品的制备

2．2．2 样品的表征

2．3 结果

2．3．1 铁(Ⅲ)离子与姜黄素对丝素蛋白构象转变的影响

2．3．2 铝(Ⅲ)离子与姜黄素对丝素蛋白构象转变的影响

2．3．3 金属离子与丝素蛋白的络合作用

2．4 讨论

2．4．1 铝(Ⅲ)离子和铁(Ⅲ)离子与丝素蛋白的相互作用

2．4．2 姜黄素对丝素蛋白构象转变的影响

2．4．3 姜黄素和铝(Ⅲ)离子或铁(Ⅲ)离子共存时对丝素蛋白构象转变的影响

2．4．4 姜黄素干预金属离子与丝素蛋白的络合

2．5 小结

参考文献

第三章 姜黄素对铝(Ⅲ)离子诱导Aβ42多肽聚集及神经毒性的抑制作用

3．1 引言

3．2 样品的制各与表征

3．2．1 基因重组Aβ42多肽的表达与纯化

3．2．2 Aβ42聚集体的制备

3．2．3 圆二色谱(circular dichroism，CD)

3．2．4 ThT荧光谱(Thioflavin T fluorescence spectroscopy，ThT-FLS)

3．2．5 原子力显微镜(atomic force microscopy，AFM)

3．2．6 Bradford法

3．2．7 细胞培养

3．2．8 MTT方法

3．2．9 X射线吸收精细结构(X-ray absorption fine structure，XAFS)

3．2．10 动态光散射(dynamic light scattering，DLS)

3．3 实验结果

3．3．1 铝(Ⅲ)和姜黄素对Aβ42多肽二级结构转变的影响

3．3．2 铝(Ⅲ)和姜黄素对Aβ42多肽纤维化动力学的影响

3．3．3 铝(Ⅲ)离子和姜黄素对Aβ42多肽聚集体形貌的影响

3．3．4 动态光散射分析蛋白聚集体尺寸

3．3．5 Bradford法分析蛋白含量

3．3．6 铝(Ⅲ)和姜黄素干预Aβ42多肽聚集体的神经毒性

3．3．7 铝(Ⅲ)—姜黄素络合物对Aβ42纤维的解聚集作用

3．3．8 金属离子与Aβ42多肽的络合作用

3．4 讨论

3．4．1 姜黄素和铝(Ⅲ)对Aβ42纤维化的影响

3．4．2 Aβ42聚集体构象、形貌以及神经毒性的相关性

3．4．3 铝(Ⅲ)—姜黄素络合物作为AD治疗药物的可能性

3．5 小结

参考文献

第四章 海藻糖对野生型和A53T突变型α-突触核蛋白纤维化聚集的干预作用

4．1 引言

4．2 样品的制备和表征

4．2．1 材料

4．2．2 重组人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白聚集体的生成

4．2．3 圆二色谱

4．2．4 ThT荧光

4．2．5 原子力显微镜

4．3 结果

4．3．1 海藻糖对A53T突变型α-突触核蛋白二级结构、聚集动力学和聚集体形貌的影响

4．3．2 海藻糖对野生型α-突触核蛋白二级结构、聚集动力学和聚集体形貌的影响

4．4 讨论

4．4．1 海藻糖对野生型和A53T突变型α-突触核蛋白纤维化的影响

4．4．2 海藻糖对野生型和A53T突变型α-突触核蛋白纤维化的干预机理

4．5 小结

参考文献

第五章 海藻糖和姜黄素干预野生型和A53T突变型α-突触核蛋白在转基因PC12细胞模型中的过表达和细胞毒性

5．1 引言

5．2 样品的制备和表征

5．2．1 人野生型和A53T突变型α-突触核蛋白慢病毒表达载体的构建及在PC12细胞中的转染

5．2．2 细胞培养

5．2．3 实验所用试剂配制

5．2．4 Western Blot分析

5．2．5 RT-PCR方法(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)

5．2．6 荧光定量实时PCR(Real-time PCR)

5．2．7 MTT实验

5．2．8 数据分析

5．3 结果

5．3．1 海藻糖对转染野生型α-突触核蛋白基因PC12细胞的影响

5．3．2 海藻糖对转染A53T突变型α-突触核蛋白基因PC12细胞的影响

5．3．3 姜黄素对转染A53T突变型α-突触核蛋白基因PC12细胞的影响

5．4 讨论

5．4．1 海藻糖对α-突触核蛋白过表达及细胞活力的干预作用

5．4．2 姜黄素对α-突触核蛋白过表达及细胞活力的干预作用

5．4．3 海藻糖作为潜在的帕金森病治疗药物

5．5 小结

参考文献

第六章 全文总结

附录Ⅰ：作者简介

附录Ⅱ：攻读博士期间发表及待发表的论文、著作

致谢

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