臭氧和大气细颗粒物对大鼠心肺系统的影响及其机制研究

摘要

大气环境中包含多种环境污染物，其中颗粒物和臭氧是较为常见的污染物。城市中颗粒物在交通高峰期浓度达到最高，臭氧是氮氧化物(NOx)和挥发性有机物(VOCs)的二次污染物，与光照有关，一般在下午的时候达到最大值。在一天当中，两者的联合暴露会发生，而暴露于多种不同的环境污染物对健康的损害效应可能比暴露于单一污染物的毒性作用更强，所以无论是对流行病学研究，还是对毒理学的生物机制研究来说，考虑两者的联合暴露对健康的影响有重要意义。根据以往的研究结果，既然颗粒物引起的心血管效应机制涉及肺、心脏和血管系统等多个部分，因此我们并行检测肺、心脏和动脉的改变以评价臭氧和PM2.5暴露对肺、心血管系统的毒性效应及其作用机制。
　　直到目前为止，对于评价人类暴露于多种环境污染物的健康风险仍然没有统一的标准。我们的研究中采用亚急性的暴露（2次/周，共3周）来评价由不同剂量的PM2.5单独暴露或者臭氧与不同剂量PM2.5联合暴露对Wistar大鼠肺、心血管系统的损伤效应。我们采用每次4小时的0.8ppm臭氧暴露和三个剂量的PM2.5（0.2、0.8和3.2mg/只）暴露。具体的暴露方法是，48只7周龄Wistar大鼠随机分为8组，每组6只。PM2.5低、中、高剂量组每只动物分别经气管滴注0.2、0.8和3.2mg的细颗粒物。臭氧和PM2.5联合暴露低、中、高剂量组为大鼠先暴露于0.8ppm的臭氧4小时，然后再气管滴注0.2、0.8和3.2mg的细颗粒物。对照组为滴注相同体积(0.20ml)的生理盐水，臭氧单独暴露组为先0.8ppm臭氧暴露4小时，然后滴注相同体积的生理盐水。暴露前和暴露期间每周称体重一次。暴露3次（暴露中期）24小时后，麻醉动物，进行心电图(ECG)记录，分析低频(LF)、高频(HF)、低频/高频(LF/HF)、总变异(TV)等反应心率变异性(HRV)的参数。末次暴露24小时后，麻醉动物，颈动脉插管测定血压(BP)，同时进行心电图(ECG)记录，分析HRV参数。然后腹主动脉取血处死动物，分别收集全血和支气管肺泡灌洗液(BALF)。检测BALF中肺炎症损伤指标:肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和细胞总数及巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的分类计数;肺上皮损伤指标:乳酸脱氢酶(LDH)的活性和碱性磷酸酶(AKP)活性;肺渗透性指标:总蛋白(TP)和白蛋白(TLB);肺组织氧化应激指标:超氧化物歧化酶(SOD)活力、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力和丙二醛(MDA)含量;肺血管内皮结构与功能指标:实时定量PCR法检测诱导性一氧化氮合酶(iNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、和细胞间粘附分子(ICAM-1)mRNA基因表达及比色法测定BALF中一氧化氮(NO)。心脏血管内皮结构与功能指标:实时定量PCR法测定iNOS、eNOS、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和ICAM-1mRNA基因表达;心脏组织内氧化应激指标:SOD活力、GSH-PX活力和MDA含量。检测胸主动脉中MMP-2和ICAM-1mRNA基因表达。测定血清中系统炎症指标:ELISA法检测TNF-α、IL-6和C-反应蛋白（CRP），比色测定LDH和肌酸激酶(CK);系统氧化应激指标:血清MDA;内皮结构与功能指标:ELISA法检测血浆内皮素-1(ET-1)、血清血管内皮生长因子(VEGF)、血清NO含量。取主支气管、未灌洗的左肺、右心室心室肌和胸主动脉进行HE染色组织学检查，其中肺组织和心脏组织也通过透射电镜(TEM)观察超微结构。分析肺与心血管系统炎症反应、炎症反应与氧化应激、炎症反应与心率变异性和炎症反应与血管内皮结构与功能之间的相关性。另外，我们也分析了PM2.5单独暴露和臭氧与PM2.5联合暴露的肺、心血管毒性的暴露-反应关系及两种暴露方式的暴露-反应相关性是否一致，进而分析在肺及心血管系统内部及两者之间的分子病理机制的关联性、臭氧暴露对颗粒物毒性效应的影响及毒性作用通路的变化。
　　该研究的结果表明，在我们的研究中，臭氧和PM2.5暴露延缓了大鼠体重的增长。PM2.5单独暴露组的BALF中细胞总数明显增加。PM2.5的滴注引起肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、LDH和总蛋白含量的明显增加(P＜0.05)。臭氧单独暴露没有引起这些肺损伤指标的显著变化。但是，臭氧可以提高由PM2.5引起的大鼠肺组织的炎症和病理改变。与对照组比较，不论是颗粒物的单独暴露还是与臭氧的联合暴露，肺组织中SOD和GSH-Px的活力均降低。而肺组织中反应内皮功能的iNOS、eNOS和ICAM-1 mRNA基因表达则有不同的变化，其中，在高剂量的PM2.5单独暴露组和3个联合暴露组中iNOS基因表达明显上调，而eNOS在任何一种暴露方式的作用下均没有明显的改变。虽然PM2.5的单独暴露没有引起ICAM-1基因表达的明显改变，但是在臭氧和PM2.5的联合作用下，肺组织中的ICAM-1表达明显上调。主支气管的病理学检查发现，除对照组外，其余暴露组均表现出不同程度的炎症细胞增生、聚集及粘膜上皮细胞的脱落等病理变化。肺组织病理学结果表明，所有PM2.5暴露组均呈现不同程度的炎症损伤，并随暴露剂量的增加有加重的趋势。肺的超微结构观察发现PM2.5对肺细胞的损伤主要体现在对肺泡Ⅱ型细胞线粒体的病理影响，即造成线粒体的肿胀、空泡及增多等病变。
　　在对心血管系统的损伤上，与对照组比较，暴露3周后，高剂量PM2.5(3.2mg/只)组的血压明显升高(P＜0.05)，心率则无明显改变。PM2.5单独暴露组可以引起血清CRP、MDA、 CK、ET-1含量和血压的明显增加及HRV参数的显著降低。大鼠的臭氧单独暴露没有引起这些指标的明显改变。但是，臭氧和PM2.5的联合暴露引起CRP,IL-6，CK，LDH和MDA剂量-效应趋势的增加及SOD和HRV以剂量-效应趋势的降低。同时，在PM2.5单独暴露及联合暴露组中，ECG均表现出异常的放电类型。心脏组织病理学检查发现，PM2.5暴露组中观察到颗粒物的沉积，只有在高剂量的联合暴露组中观察到心肌炎症。TEM的结果也表明臭氧单独暴露、高剂量PM2.5暴露以及两者的联合作用可引起超微结构的改变，主要是心肌结构紊乱、肌丝的溶解断裂、线粒体肿胀和空泡化。另外，PM2.5的单独及与臭氧的联合暴露均可以上调动脉中MMP-2和ICAM-1mRNA基因表达。说明调节动脉血管结构的转录机制和内皮功能受到影响。但是在所有暴露组中，腹主动脉的HE染色结果没有发现动脉的明显病理变化。
　　肺及心血管系统毒性作用机制的关联性分析表明，肺的炎症效应、心血管系统的炎症/氧化应激指标与HRV参数之间存在显著的相关性。血浆ET-1的含量与大鼠心脏组织中的MMP-2的表达没有显著的相关性，但与动脉中MMP-2的表达显著相关。PM2.5的单独暴露与臭氧和PM2.5的联合暴露两组暴露方式的暴露-反应相关性研究表明，对于检测颗粒物的肺毒性效应，LDH、总蛋白、白蛋白、iNOS mRNA、SOD、GSH-PX和MDA等指标可能更为敏感，而臭氧对AKP、IL-6、ICAM-1 mRNA等指标的影响较大。两种暴露方式对心血管系统影响的结果提示，CRP和ET-1等指标对PM2.5暴露较为敏感，而TNF-α、IL-6和TV等指标可能对于臭氧暴露更为敏感一些，VEGF则对PM2.5或臭氧的敏感性都较差。
　　总之，这一暴露剂量(0.8ppm)和暴露时间（2次/周，共3周）的臭氧对肺及心血管系统的损伤较小。高剂量的PM2.5能引起大鼠肺损伤，包括细胞毒性、白细胞浸润、前炎症细胞因子、氧化应激以及组织病理变化。大鼠肺的损伤主要由PM2.5所引起，但同时这一效应可被臭氧的联合暴露所提高。同样剂量的PM2.5单独暴露也可以引起心血管系统炎症和氧化应激损伤、内皮功能和自主神经系统(ANS)的紊乱。臭氧和PM2.5可引起心脏组织和全身系统明显的损伤，并且这种影响存在剂量-效应趋势。所以在臭氧和PM2.5联合作用于生物体时，自主神经系统和炎症/氧化应激反应均参与到毒性的产生过程中。事实上，所有这些通路是相关联的，当评价臭氧和细颗粒物的毒性时，很难区分每一个通路的独立参与。

目录

声明

缩略词表

摘要

前言

技术路线

第一部分 臭氧和大气细颗粒物对大鼠肺的毒性研究

第一节 臭氧和大气细颗粒物对大鼠肺部的炎症影响

第二节 臭氧和大气细颗粒物对大鼠肺部氧化应激的影响

第三节 臭氧和大气细颗粒物对大鼠肺部和支气管组织形态的影响

第一部分 小结

第二部分 臭氧和大气细颗粒物对大鼠心血管系统的毒性

第一节 臭氧和大气细颗粒物对大鼠心脏自主神经功能的影响

第二节 臭氧和大气细颗粒物对大鼠心血管系统炎症损伤

第三节 臭氧和大气细颗粒物对大鼠心血管系统氧化应激损伤

第四节 臭氧和大气细颗粒物对大鼠心血管系统内皮功能的影响

第五节 臭氧和大气细颗粒物对大鼠心脏、动脉组织形态的影响

第二部分 小结

第三部分 臭氧和大气细颗粒物对大鼠肺和心血管系统毒性效应机制的关联性研究

第三部分 小结

结语

参考文献

文献综述 大气细颗粒物和臭氧对心肺系统疾病影响的研究进展

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