RVG29修饰脑靶向纳米药物递释系统的研究

摘要

神经退行性疾病(Neurodegenerative diseases)是一类以脑部神经元发生退行性病变为特征的慢性疾病，其临床症状体现在运动或记忆方面的障碍，主要是由于负责相关功能的神经元或其髓鞘发生缺失所导致的。常见的神经退行性疾病包括帕金森病(Parkinson's disease，PD)和阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)等。神经退行性疾病的主要特点是病程长、进展缓慢、神经元一旦发生死亡无法再生以及疾病的进程不可逆转。因此，实现神经退行性疾病的早期诊断和治疗至关重要。
　　在神经退行性疾病的早期阶段，脑部结构和功能的变化并不明显，需要依赖于特定的疾病标记物分子的变化情况进行诊断。近年来分子荧光探针已广泛应用于肿瘤等疾病的诊断成像研究，它的主要优点是灵敏度高，适用于疾病早期标记物的检测，因此本课题选择分子荧光探针作为神经退行性疾病的诊断策略。基因药物特别是近年来研究较为深入的RNA干扰（RNA interfering，RNAi）药物，由于其治疗的特异性强并且治疗效果明显，具有非常广阔的临床应用前景。所以，本课题选择基因治疗作为神经退行性疾病的主要治疗手段。如何实现诊断和治疗药物的脑部递送是本课题主要关注和重点解决的问题。
　　血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）主要是由脑毛细血管内皮细胞(braincapillary endothelial cells，BCECs)形成紧密连接组成的，主要存在于血液和中枢神经系统(central nervous system，CNS)之间的屏障结构。它的存在一方面起到神经保护的作用，保证中枢神经系统较少被外来物质侵扰，维持高度的稳态，同时为脑内输送营养物质;另一方面，BBB的致密结构也阻碍了用于脑部疾病诊断和治疗的药物通过非侵入性给药方式进入脑内。
　　本课题选用由狂犬病毒糖蛋白衍生的一段29个氨基酸序列的多肽(命名为RVG29)作为脑靶向分子，将其修饰于药物递释系统中，利用RVG29与其BBB上受体结合介导的穿细胞作用，将药物从血液转运至脑部，实现脑靶向药物递释。
　　实现有效的脑部药物递送除了选择合适的脑靶向策略之外，对于药物的递释载体系统的选择和优化也至关重要。聚左旋赖氨酸树枝状分子(Dendrigraft L-lysines，DGLs)是由赖氨酸单体聚合形成的具有树枝状结构的高分子。由于赖氨酸单体之间利用肽键连接，所以DGLs在体内可以被酶类降解;与此同时，赖氨酸是组成生物体内蛋白的基本氨基酸，所以DGLs在体内免疫原型低，生物相容性高;DGLs表面具有丰富的氨基，可以通过共价连接等方式，对其进行多种功能化修饰。此外，DGLs表面丰富的氨基也可以通过静电复合作用与基因药物复合，作为基因递释载体。因此，本课题选择DGLs作为诊断和治疗药物递释的载体。
　　本课题第一章中首先对RVG29多肽的脑靶向性进行了评价。将RVG29多肽通过双功能聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)连接于研究应用较为成熟的聚酰胺-胺树枝状分子表面，构建了RVG29修饰的脑靶向药物递释系统，重点评价了其体内外的脑靶向性，主要考察了其脑部基因递释的能力。
　　本课题第二章研究主要是针对在帕金森病早期阶段的凋亡诊断。在此阶段主要发生了由casapase-3激活诱导的神经元凋亡。为了提高荧光成像的对比度，引入了荧光能量共振转移技术（fluorescence resonance energy transfer, FRET）技术。将荧光能量共振转移荧光对（荧光分子和其淬灭剂）分别修饰于DGLs表面，利用可以被激活型caspase-3特异性识别和剪切的多肽序列DEVD作为连接分子，通过caspase-3激活的发生与否来控制FRET效应的开启或关闭，进一步结合脑靶向多肽RVG29的修饰，构建成为DGLs-RVG29-FRET纳米器件，能够实现体内激活型caspase-3特异性的响应并进行荧光成像，进而可以进行帕金森病的早期凋亡诊断。
　　本课题第三章研究构建了DGLs-PEG-RVG29包载DNA的脑靶向基因递释系统。RVG29修饰的DGLs脑靶向基因递释系统保留了聚酰胺-胺系统的脑靶向基因递释特性，同时给药系统的生物安全性有所提高。
　　本课题第四章的研究中，将第三章中构建的脑靶向基因递释系统应用于帕金森病的治疗。以下调脑内的caspase-3水平作为治疗靶点，因为caspase-3的激活不仅可以直接诱导神经细胞凋亡，还可以通过上调脑胶质细胞中炎症因子的水平，产生神经细胞毒作用，间接引起神经细胞的死亡。在鱼藤酮诱导的帕金森病大鼠模型上，RVG29修饰的DGLs脑靶向基因递释系统能够高效的递送干扰caspase-3表达的治疗基因进入脑内。通过疾病早期多次给药，降低caspase-3酶原的水平，减少caspase-3的激活。从行为学，免疫组化等指标考察了RVG29修饰的DGLs脑靶向基因递释系统的在疾病动物模型上的药效。通过脑组织凋亡分析和脑中细胞炎症水平的测定，阐述了产生治疗效果的双重作用机制。
　　在本课题第五章的研究中，针对阿尔茨海默病的两个典型的病理特征，一是由于BACE1(beta-site APP-cleaving enzyme1)代谢途径失调引发的淀粉样蛋白（amyloid beta，Aβ）沉积;另一种是tau过度磷酸化代谢异常引起的细胞内神经纤维缠结。BACE1的水平可以利用RNA干扰进行基因药物调节。研究发现一段6个氨基酸的D型肽可以抑制神经纤维的缠结。利用DGLs的树枝状结构，除了对其进行基本的脑靶向修饰外，将具有治疗作用的多肽也修饰其上，进一步包载能够特异性干扰BACE1表达的基因药物，实现基因-多肽药物向脑内的共递送。针对于AD病理机制的进行双靶点干预治疗，达到治疗AD的目的。通过BACE1水平的测定和水迷宫行为学实验进行治疗的药效学评价，通过对淀粉样蛋白以及磷酸化的tau的免疫染色，对于治疗的机制进行探索。

目录

摘要

前言

第一章 RVG29多肽的脑靶向性评价

1 仪器和材料

1．1 材料和试剂

1．2 仪器

1．3 细胞株

1．4 实验动物

2 实验方法

2．1 PAMAM-PEG-RVG29的合成

2．2 PAMAM-PEG-RVG29的合成验证

2．3 PAMAM-PEG-RVG29／DNA纳米粒的制备与表征

2．4 BCECs对PAMAM-PEG-RVG29／DNA摄取情况考察

2．5 PAMAM-PEG-RVG29／DNA纳米粒在细胞内的定位考察

2．6 PAMAM-PEG-RVG29／DNA纳米粒跨体外BBB模型转运

2．7 活体成像分析PAMAM-PEG-RVG29／DNA纳米粒的分布

2．8 PAMAM-PEG-RVG29／DNA纳米粒在小鼠脑内表达评价

2．9 数据分析

3 实验结果

3．1 PAMAM-PEG-RVG29的合成验证

3．2 PAMAM-PEG-RVG29／DNA纳米粒的表征

3．3 BCECs对PAMAM-PEG-RVG29／DNA纳米粒的摄取及机制探索

3．4 PAMAM-PEG-RVG29／DNA纳米粒摄取后的细胞内定位

3．5 PAMAM-PEG-RVG29／DNA纳米粒跨BCECs单层转运

3．6 PAMAM-PEG-RVG29／DNA纳米粒的体内分布

3．7 PAMAM-PEG-RVG29／DNA纳米粒在脑内表达的定性考察

3．8 PAMAM-PEG-RVG29／DNA纳米粒在体内表达的定量考察

4 讨论

4．1 RVG29修饰的载基因纳米粒的体外靶向性研究

4．2 PAMAM-PEG-RVG29／DNA纳米粒的体内靶向性研究

5 小结

第二章 RVG29修饰脑靶向纳米器件用于帕金森病的早期凋亡诊断

1 仪器和材料

1．1 材料和试剂

1．2 仪器

1．3 细胞株

1．4 实验动物

2 实验方法

2．1 DGLs-RVG29-FRET纳米器件的合成

2．2 DGLs-RVG29-FRET纳米器件的表征

2．3 DGLs-RVG29-FRET纳米器件的稳定性考察

2．4 DGLs-RVG29-FRET纳米器件的细胞毒性考察

2．5 DGLs-RVG29-FRET纳米器件跨BCECs单层转运实验

2．6 体外caspase-3激活模型的建立

2．7 利用DGLs-RVG29-FRET纳米器件进行激活型caspase-3的体外检测

2．8 DGLs-RVG29-FRET纳米器件的离体组织分布

2．9 体内caspase-3激活模型的建立

2．10 DGLs-RVG29-FRET纳米器件应用于活体caspase-3成像

2．11 DGLs-RVG29-FRET纳米器件在脑部分布与定位

2．12 数据分析

3 实验结果

3．1 DGLs-RVG29-FRET纳米器件的合成表征

3．2 DGLs-RVG29-FRET纳米器件的稳定性考察

3．3 DGLs-RVG29-FRET纳米器件的安全性考察

3．4 DGLs-RVG29-FRET纳米器件跨BCECs单层转运

3．5 体外caspase-3激活模型的建立

3．6 DGLs-RVG29-FRET纳米器件应用于细胞内的激活型caspase-3检测

3．7 DGLs-RVG29-FRET纳米器件的离体组织分布

3．8 体内caspase-3激活模型的建立

3．9 DGLs-RVG29-FRET纳米器件应用于脑内的激活型caspase-3检测

3．10 DGLs-RVG29-FRET纳米器件在脑部分布与定位

4 讨论

5 小结

第三章 RVG29修饰脑靶向纳米基因递释系统的构建和表征

1 仪器和材料

1．1 材料和试剂

1．2 仪器

1．3 细胞株

1．4 实验动物

2 实验方法

2．1 DGLs-PEG-RVG29的合成

2．2 DGLs-PEG-RVG29的合成验证

2．3 DGLs-PEG-RVG29／DNA纳米粒的制备与表征

2．4 DGLs-PEG-RVG29／DNA纳米粒跨BCECs单层转运实验

2．5 DGLs-PEG-RVG29／DNA纳米粒细胞毒性考察

2．6 活体成像分析DGLs-PEG-RVG29／DNA纳米粒的分布

2．7 DGLs-PEG-RVG29／DNA纳米粒在脑内的分布

2．8 数据分析

3 实验结果

3．1 DGLs-PEG-RVG29的合成验证

3．2 DGLs-PEG-RVG29／DNA纳米粒的表征

3．3 DGLs-PEG-RVG29／DNA纳米粒跨BCECs单层转运

3．4 DGLs-PEG-RVG29／DNA纳米粒的安全性考察

3．5 DGLs-PEG-RVG29／DNA纳米粒的体内分布

3．6 DGLs-PEG-RVG29／DNA纳米粒的在脑内的分布

4 讨论

5 小结

第四章 RVG29修饰脑靶向纳米基因递释系统用于帕金森病的治疗

1 仪器和材料

1．1 材料和试剂

1．2 仪器

1．3 细胞株

1．4 实验动物

2 实验方法

2．1 DGLs-PEG-RVG29的合成

2．2 DGLs-PEG-RVG29／DNA纳米粒的制备

2．3 Caspase-3 shRNA编码质粒的筛选

2．4 鱼藤酮诱导的帕金森病大鼠模型以及给药方案

2．5 实时定量RT-PCR分析caspase-3 mRNA水平

2．6 Western blot检测激活型caspase-3水平

2．7 免疫荧光分析激活型caspase-3

2．8 黑质中酪氨酸羟化酶TH-免疫组化分析

2．9 体视学计数

2．10 行为学评价(Open-field test旷场实验)

2．11 体内凋亡检测TUNEL分析

2．12 ELISA测定脑组织中TNF-α水平

2．13 Griess Assay测定脑组织中NO含量

2．14 数据分析

3 实验结果

3．1 Caspase-3 shRNA编码质粒的筛选结果

3．2 RT-PCR测定Caspase-3 mRNA水平结果

3．3 激活型caspase-3蛋白水平Western blot分析结果

3．4 激活型caspase-3的免疫荧光分析结果

3．5 大鼠体重变化

3．6 行为学评价结果

3．7 TH免疫组化评价结果

3．8 TUNEL检测脑组织中凋亡情况

3．9 TNF-α水平测定

3．10 NO水平测定

4 讨论

5 小结

第五章 RVG29修饰脑靶向纳米基因-多肽递释系统用于阿尔茨海默病的治疗

1 仪器和材料

1．1 材料和试剂

1．2 仪器

1．3 细胞株

1．4 实验动物

2 实验方法

2．1 DGLs-PEG-RVG29-D-peptide的合成

2．2 DGLs-PEG-RVG29-D-peptide的合成验证

2．3 DGLs-PEG-RVG29-D-peptide／DNA纳米粒的制备

2．4 DGLs-PEG-RVG29-D-peptide／DNA纳米粒的表征

2．5 BACE1-AS shRNA编码质粒的构建

2．6 DGLs-PEG-RVG29-D-peptide／DNA纳米粒跨BCECs单层转运实验

2．7 SH-SY5Y细胞对DGLs-PEG-RVG29-D-peptide／DNA纳米粒的摄取考察

2．8 活体成像分析DGLs-PEG-RVG29／DNA纳米粒的分布

2．9 给药方案

2．10 实时定量RT-PCR分析BACE1 mRNA和BACE1-AS水平

2．11 Western blot检测BACE1蛋白水平

2．12 BACE1在脑中的免疫荧光染色

2．13 Aβ淀粉样斑块的硫磺素-S染色

2．14 磷酸化的tau蛋白(p-tau)免疫荧光染色

2．15 Morris水迷宫行为学评价

2．16 数据分析

3 实验结果

3．1 DGLs-PEG-RVG29-D-peptide的合成验证

3．2 DGLs-PEG-RVG29-D-peptide／DNA纳米粒的表征

3．3 DGLs-PEG-RVG29-D-peptide／DNA纳米粒跨BCECs单层转运

3．4 DGLs-PEG-RVG29-D-peptide／DNA纳米粒的细胞摄取结果

3．5 DGLs-PEG-RVG29-D-peptide／DNA纳米粒的体内分布

3．6 脑内海马区域BACE1 mRNA和BACE1-AS水平测定结果

3．7 脑内海马区域BACE1蛋白水平Western blot分析结果

3．8 脑内海马区域的BACE1免疫荧光分析结果

3．9 Aβ淀粉样斑块的硫磺素-S染色结果

3．10 磷酸化的tau蛋白免疫荧光染色结果

3．11 Morris水迷宫行为学评价结果

4 讨论

5 小结

全文总结

创新性

中英文缩写对照

参考文献

综述 脑靶向纳米药物递释系统

论文

专利

致谢

声明