肿瘤靶向聚酰胺-胺树枝状聚合物纳米递药系统的研究

摘要

由于大多数抗肿瘤药物缺乏组织特异性，导致严重的毒副作用，主动靶向纳米递药载体由于可选择性将抗肿瘤药递送到肿瘤组织，以及通过配体-受体相互作用，递送到肿瘤细胞，从而提高疗效减轻毒性，逐渐成为药剂学研究的热点。
　　本课题分为两部分，Trastuzumab介导 PAMAM-paclitaxel偶联物的研究及RGD多肽介导PAMAM/methotrexate复合物的研究。分别以4代和5代聚酰胺-胺（PAMAM）树枝状聚合物为药物载体，紫杉醇（paclitaxel，PTX）和甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）为模型药物，曲妥珠单抗（trastuzumab，TMAB）和RGD多肽为靶向头基，HER2受体和整合素受体为作用靶点，构建TMAB-PEG-PAMAM-PTX偶联物和RGDTAT-PEG-PAMAM/MTX复合物，并进一步对其肿瘤靶向作用进行研究。本文主要从以下章节进行研究：
　　第一部分 Trastuzumab介导PAMAM-paclitaxel偶联物的研究
　　1 TMAB-PEG-PAMAM-PTX/FITC/Cy7偶联物纳米递药系统的合成。分子量3500Da的双功能聚乙二醇NHS-PEG-MAL通过酰胺化反应，与PAMAM氨基共价结合合成 PEG-PAMAM偶联物；TMAB通过 Traut’s试剂修饰巯基后，与NHS-PEG-MAL马来酰亚胺基共价结合，合成TMAB-PEG-PAMAM偶联物；PTX通过丁二酸酐（Succinic anhydride）与 PAMAM共价结合，合成 TMAB-PEG-PAMAM-PTX偶联物；标记荧光探针 FITC和Cy7-NHS，合成TMAB-PEG-PAMAM-FITC/Cy7偶联物。通过HNMR法测得PEG、PTX连接数分别为8、4，Bradford法测得Trastuzumab连接数为1；HNMR和紫外法测得FITC及Cy7连接数分别为4和1。
　　2合成 TMAB-PEG-PAMAM-PTX/FITC/Cy7偶联物后，对其理化性质进行了考察。动态光散射粒度仪（DLS）及透射电镜（TEM）测得偶联物粒径范围为10-30nm，形态近似为球形；
　　3 TMAB-PEG-PAMAM-FITC偶联物纳米递药系统的靶向性评价。通过荧光倒置显微镜、流式细胞仪对偶联物体外细胞摄取进行考察，结果表明TMAB-PEG-PAMAM-FITC偶联物与对照组PEG-PAMAM-FITC比较，HER2受体过表达BT474细胞荧光强度明显提高(大于2倍)，激光共聚焦显微镜显示偶联物聚集在溶酶体位置；体外细胞毒性实验表明TMAB-PEG-PAMAM-PTX偶联物(IC50=22.96ng/ml)对 BT474细胞细胞毒性强于 PEG-PAMAM-PTX偶联物(IC50=40.23ng/ml)，而小于 PTX原料药（13.44ng/ml）；通过小动物活体成像对TMAB-PEG-PAMAM-Cy7偶联物在荷瘤裸鼠的体内分布进行评价，结果表明TMAB-PEG-PAMAM-Cy7偶联物比对照组PEG-PAMAM-Cy7偶联物更多在肿瘤部位聚集，体外器官成像结果表明，肿瘤在所有器官组织中荧光强度最大，与对照组相比肿瘤组织荧光强度增加1.5倍。
　　第二部分 RGD多肽介导PAMAM/MTX复合物的研究
　　1首先合成了一种新型靶向头基RGDTAT多肽，并通过HPLC和MS对其进行了表征。
　　2 RGDTAT-PEG-PAMAM/MTX复合物纳米递药系统的制备。RGDTAT-PEG-PAMAM偶联物的合成采用与TMAB-PEG-PAMAM相同的方法，分子量3500Da的NHS-PEG-MAL通过酰胺化反应，与PAMAM氨基共价结合合成PEG-PAMAM偶联物；RGDTAT通过巯基与NHS-PEG-MAL马来酰亚胺基共价结合，合成RGDTAT-PEG-PAMAM偶联物；MTX通过物理包埋进入PAMAM疏水空腔。HNMR测得PEG和RGDTAT连接数分别为30和16。
　　3 RGDTAT-PEG-PAMAM/MTX复合物纳米递药系统的表征。DLS及 TEM测得其粒径在10-35nm范围；体外释放实验表明，MTX在弱酸性条件pH5.0中（12h累计释放百分率90％）释放快于pH7.4（24h累计释放90%），具有pH敏感性。
　　4 RGDTAT-PEG-PAMAM/MTX复合物纳米递药系统的靶向性评价。体外细胞摄取实验表明，RGDTAT-PEG-PAMAM/MTX复合物被整合素受体过表达HepG2细胞摄取多于 PEG-PAMAM-FITC/MTX复合物；MTT法测得RGDTAT-PEG-PAMAM/MTX复合物对整合素受体过表达 HepG2细胞细胞毒性强于对照组PEG-PAMAM/MTX复合物，而对整合素受体低表达MCF-7细胞的细胞毒性则无明显差异；小动物活体成像实验表明 RGDTAT-PEG-PAMAM-Cy7/MTX复合物更多在肿瘤部位聚集，体内具有明显靶向性。
　　5 RGDTAT-PEG-PAMAM/MTX复合物纳米递药系统的药代动力学研究。药代动力学实验表明RGDTAT-PEG-PAMAM/MTX复合物与MTX注射液相比，t1/2和AUC增加2倍，体内具有缓释效果。

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符号说明

前言

1 肿瘤治疗现状

2 树枝状聚合物

3 肿瘤病理特点

4 课题设计思路

第一部分 TMAB介导PAMAM-PTX偶联物的研究

1 PEG-PAMAM-PTX的合成及表征

2 TMAB-PEG-PAMAM-PTX的合成及表征

3 TMAB-PEG-PAMAM-FITC/Cy7的合成和表征

4 HER2靶向PAMAM-FITC偶联物的细胞摄取

5 HER2靶向PAMAM-Cy7偶联物小动物成像研究

第二部分 RGD多肽介导PAMAM/MTX复合物的研究

1 RGDTAT-PEG-PAMAM的合成和表征

2 RGDTAT-PEG-PAMAM/MTX的制备和表征

3 RGDTAT-PEG-PAMAM/MTX复合物细胞摄取和细胞毒性

4 RGDTAT-PEG-PAMAM/MTX复合物小动物成像

5 RGDTAT-PEG-PAMAM/MTX复合物药代动力学研究

6 全文结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文附录