超声辐照载药有序介孔有机硅超声造影剂靶向治疗肿瘤的实验研究

摘要

第一部分、载药有序介孔有机硅(HPMOs)造影剂用于高效的超声影像、超声辐照的药物控释和辅助肿瘤化疗
　　第一章:有序介孔有机硅(Hollow periodic mesoporous organosilicas HPMOs)的制备、理化性质及药物负载研究
　　目的:研究HPMOs的制备、理化性质及药物负载。
　　方法:采用“结构差异的选择性刻蚀法”制备HPMOs纳米粒子;纳米粒子的形态和微观结构由透射电子显微镜和扫描透射电子显微镜获得。动态光散射和N2吸附-解吸等温线测量HPMOs的粒径、比表面积、孔容和孔径;采用UV-vis吸收光谱测定PTX-HPMOs中紫杉醇(paclitaxel PTX)的负载量。
　　结果:HPMOs具有球形形貌和高分散性，表面光滑;平均粒径450.2 nm;比表面积:1029.4m2/g、孔容:0.66cm3/g、孔径:3.8nm; PTX-HPMOs中紫杉醇的载药量为91 mg/g。
　　结论:HPMOs具有纳米级的粒径和空心介孔结构;具有独特的药物封装特性，药物负载量高。
　　第二章:HPMOs作为超声造影剂在体外的超声成像研究
　　目的:评估HPMOs作为超声造影剂在体外的显像效果。
　　方法:方法1，将不同浓度(5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml)的HPMOs/PBS溶液(2ml)分别装入小水囊中，再将小水囊放入大水囊中。观察其在不同超声影像模式和不同机械指数下的显像效果。方法2，将2ml20mg/ml的HPMOs/PBS溶液和SonoVue分别抽入小注射器中，其针尖插入另一含生理盐水的大注射器中，实时注入试剂，观察显像效果。
　　结果:HPMOs作为超声造影剂在谐波（Harmonic-）和对比增强（contrast-）模式下都能获得良好的超声增强图像。并且这种增强显像具有明显的浓度和机械指数(MI)依赖性。
　　结论:HPMOs作为一种新型纳米有机/无机杂化介孔材料，因其内部大的空腔结构，可作为超声造影剂，且稳定性高，无需低机械指数条件，在常规超声条件下即可造影成像，在肿瘤化疗过程中，可以提供高质量的影像以监测治疗的效果。
　　第三章:超声辐照PTX-HPMOs体外药物释放动力学研究
　　目的:研究超声体外辐照能否智能控释HPMOs中负载的化疗药物PTX。
　　方法:将PTX-HPMOs溶于PBS释放介质中，观察自然条件下PTX-HPMOs药物释放规律;然后在不同的时间点附加超声辐照，采用UV-vis吸收光谱测定超声辐照前后释放介质中紫杉醇(PTX)的含量。
　　结果:超声辐照后，包封在HPMOs中的抗肿瘤药PTX出现突释，每次超声辐照可以增加18％的紫杉醇释放量。
　　结论:超声辐照可以明显的增加PTX从载体HPMOs中的释放量，因而超声辐照PTX-HPMOs可以作为一种刺激-响应药物释放体系，按需智能释放药物，从而可以用于肿瘤的靶向化疗。
　　第四章:超声辐照PTX-HPMOs对人宫颈癌Hela细胞作用的实验研究
　　目的:研究PTX-HPMOs结合超声辐照能否增强对人宫颈癌Hela细胞的杀伤力。
　　方法:96孔培养板分成6区（每区4个复孔）共3块培养板，种植Hela细胞，置37℃、5％ CO2培养箱中培养，细胞贴壁12小时后，吸出培养板每孔内的陈旧培养液，3块板分别加入不同浓度的裸药紫杉醇; PTX-HPMOs;第3块板在加入PTX-HPMOs后室温下经培养板底部分别对每区细胞进行治疗性超声辐照。辐照完成后继续同上条件培养24小时，行CCK-8实验检测细胞存活率。
　　结果:本实验所采用的超声辐照条件本身对细胞没有产生毒性，细胞存活率100％;而不同浓度的裸药PTX以及PTX包封在HPMOs后对细胞株均产生了一定的毒性;当PTX-HPMOs浓度为5μg/ml时，超声辐照后有64.44％的Hela细胞在24小时内死亡，细胞存活率明显低于单纯采用PTX-HPMOs或裸药。当PTX-HPMOs浓度进一步增加到10μg/ml时，超声辐照后细胞存活率进一步降低，超过75.69％的Hela细胞在24小时内死亡，明显低于单纯采用PTX-HPMOs或裸药。
　　结论:超声辐照可以有效地提高PTX-HPMOs对肿瘤细胞的杀伤效果。
　　第五章:超声辐照PTX-HPMOs对裸鼠移植瘤作用的实验研究
　　目的:评估超声辐照PTX-HPMOs对裸鼠移植瘤的治疗作用。
　　方法:将成功建立裸鼠皮下Hela人宫颈癌细胞移植瘤模型的12只裸鼠随机分成4组，每组3只。各组的处理方法分别为，对照组肿瘤内注入生理盐水;紫杉醇组肿瘤内注入临床常用药PTX; PTX-HPMOs组肿瘤内注入PTX-HPMOs;PTX-HPMOs+US组与PTX-HPMOs组给药方法相同，给药后将超声治疗仪探头直接辐照肿瘤组织区域。
　　结果: PTX-HPMOs+US组肿瘤生长受到明显的抑制，和对照组相比，差异明显;治疗后PTX-HPMOs+US组肿瘤重量为0.27±0.08g，对照组肿瘤重量为0.69±0.14g，PTX-HPMOs组肿瘤重量为0.49±0.10g，PTX组肿瘤重量为0.44±0.11g，PTX-HPMOs+US组和其余3组相比，瘤重抑瘤率均有明显的差异。结论:超声辐照PTX-HPMOs具有优越的抗肿瘤效果。
　　第六章:HPMOs作为超声造影剂在裸鼠体内的超声成像研究
　　目的:评估HPMOs作为超声造影剂在裸鼠体内的超声成像效果。
　　方法:将成功建立裸鼠皮下移植瘤模型的9只裸鼠随机分成3组，每组3只。对照组经尾静脉注入生理盐水;SonoVue组注入SonoVue: PTX-HPMOs组注入PTX-HPMOs。分别在注入即刻、30s和第7天时观察肿瘤组织内回声情况。
　　结果:SonoVue在肿瘤内呈快进快出的显像模式，2分钟后肿瘤内即不能检出造影剂的存留;PTX-HPMOs在肿瘤组织内能快速弥散，弥散均匀，且PTX-HPMOs在肿瘤内存留时间长，7天后肿瘤内仍然能检出造影剂的颗粒。
　　结论:PTX-HPMOs作为超声造影剂在裸鼠肿瘤组织内有良好的超声显像效果，稳定性好。在肿瘤组织内该纳米粒子能快速弥散，且弥散均匀。重要的是，PTX-HPMOs在肿瘤内存留时间长，能起到缓慢释药的效果。
　　综上所述，超声辐照载药超声造影剂靶向肿瘤化疗成为目前一项具有挑战性的研究——其同时具有药物携带和传递、被动靶向肿瘤、超声药物控释、肿瘤超声实时增强显像的功能。
　　第二部分、载药有序介孔有机硅造影剂在HIFU肿瘤综合诊治体系中的应用探索
　　第一章:HPMOs负载抗癌药物阿霉素(Doxorubicin DOX)的研究
　　目的:评估HPMOs作为药物载体负载DOX的能力。
　　方法:采用UV-vis吸收光谱测定DOX-HPMOs中阿霉素的负载量。
　　结果:DOX-HPMOs的载药量94.2mg/g。
　　结论:HPMOs的药物负载量高，这一高的负载量主要归因于巨大的空腔结构，以及具有较大比表面积/孔容的介孔壳层的双重贡献。
　　第二章:HIFU辐照DOX-HPMOs体外药物释放动力学研究
　　目的:研究HIFU体外辐照能否智能控释HPMOs中负载的化疗药物DOX。
　　方法:将DOX-HPMOs溶于PBS释放介质中，配制成浓度为5mg/ml的溶液，吸取4个1ml，分别置于透析袋中，再将透析袋置于50ml PBS释放介质中，并将透析袋置于HIFU的焦点处。采用不同的HIFU能量释放模式以及不同的功率和时间进行体外释放考察。在HIFU辐照前后取样，测量样品中DOX的含量。
　　结果:DOX从载体HPMOs中的释放不受温度的影响。PW-HIFU(200W/cm260s)辐照DOX-HPMOs1次可以增加15％的DOX释放量。DOX-HPMOs暴露在PW-HIFU后，样品局部的温度轻微上升;200W CW-HIFU辐照DOX-HPMOs4分钟后，DOX释放了76.15％，等同于PW-HIFU(200W/cm260s)间隙辐照DOX-HPMOs4次，但局部温度上升明显，从37上升到50℃。
　　结论:PW-HIFU和CW-HIFU均可以有效地控释DOX，但PW-HIFU避免了CW-HIFU连续发射超声波所致的温度升高，从而避免了对周围正常组织的热损伤，重要的是，温度的上升并不能促进DOX从载体中的释放。因此，我们设想DOX-HPMOs的高载药量，再加上PW-HIFU可以有效地控释DOX，那么这一新型的纳米材料就可以用于HIFU介导的药物控释和辅助肿瘤化疗。
　　第三章: DOX-HPMOs细胞内的摄取研究
　　目的:评估DOX-HPMOs纳米粒子能否被肿瘤细胞主动吸收。
　　方法:Hela人宫颈癌细胞接种到共聚焦皿中，在37摄氏度5％的CO2培养箱中培养24h，弃去共聚焦皿中培养液，加入1ml含有50ug/ml的DOX-HPMO的培养液分别培养2h、6h，在共聚焦显微镜下观察并拍照。对照组加入含药浓度相同的裸药阿霉素培养液。每组共聚焦照片分三张，分别是明场像、荧光像和融合像。
　　结果:DOX-HPMOs和Hela细胞共培养2小时后，共聚焦显微镜观察到DOX的红色荧光强烈定位在细胞内，且荧光强度强于裸药DOX;6h后，其细胞核中也观察到了DOX的红色荧光，而与DOX共培养的Hela细胞，6h后其细胞核中DOX的红色荧光不明显。
　　结论: DOX-HPMOs可以被Hela细胞主动吸收到细胞内，保证了HPMOs中所封装药物的细胞内高输送效率，可以导致更高的细胞毒性。更为重要的是，该纳米粒子被细胞吞噬后不仅能进入细胞质，而且能透过核膜进入细胞核。
　　第四章:HPMOs在离体脱气牛肝组织中的HIFU增效实验
　　目的:评价HPMOs在离体脱气牛肝组织中的HIFU增效效果。
　　方法:新鲜脱气牛肝置入脱气水囊中。沿HIFU治疗头X轴方向取3个连续层面。用5ml注射器针头+1ml注射器吸取试剂(PBS、HPMOs/PBS)，将针头垂直刺入牛肝中间深度，在超声监视下，迅速注射入0.3ml的各个实验组试剂，并立即在注射点分别用一定剂量的HIFU进行辐照(100W/cm27s;150W/cm24s)，消融后坏死的牛肝组织可以通过超声影像灰度的变化实时显示。辐照结束后，测量坏死区域体积。
　　结果:注入HPMOs后HIFU(150W/cm24s)局部辐照牛肝，灰度值达98±6.87dB，而单纯注入PBS溶液，局部HIFU辐照后牛肝灰度值13±1.39dB;牛肝组织局部注入不同的材料，HIFU消融坏死的平均容积分别为:HPMOs/PBS(150W/cm24s28.29mm3;100W/cm27s11.97mm3);PBS(150W/cm24s12.43mm3;100W/cm27s8.58rnm3)。牛肝局部注入HPMOs/PBS后， HIFU(150W/cm24s)消融的容积明显增大;注入HPMOs/PBS后，HIFU100W/cm27s作用和注入PBS后，HIFU150W/cm24s作用，局部消融的容积相当。
　　结论:HPMOs/PBS可以作为HIFU治疗的增效剂，明显增强HIFU消融治疗的效果，在HIFU低功率的同时达到高效的消融效果，同时避免对周围正常组织的热损伤。
　　第五章:HIFU联合DOX-HPMOs治疗ICR小鼠S-180肉瘤的疗效实验
　　目的:评估HIFU联合DOX-HPMOs综合治疗ICR小白鼠S-180肉瘤的疗效
　　方法:将建立小白鼠皮下移植瘤模型的20只鼠随机分成4组，每组5只。(i)单纯HIFU组;(ii)单纯DOX-HPMOs组;(iii) DOX-HPMOs+HIFU组;(iV)对照组。上述处理方法每组每周1次，连续2周。每2天测量一次肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线。实验第15天处死小白鼠，剥离肿瘤。用游标卡尺测量肿瘤结节大小，用电子天平测量肿瘤重量，计算瘤重抑瘤率和体积抑瘤率。取肿瘤组织浸泡于多聚甲醛溶液中，送病理科作切片HE染色，光镜下观察细胞坏死情况，石蜡切片TUNEL染色观察细胞凋亡情况。
　　结果:DOX-HPMOs+HIFU组的体积抑瘤率为80％，而单纯HIFU组以及DOX-HPMOs组分别为51.10％和69.22％，DOX-HPMOs+HIFU组与单纯HIFU组以及DOX-HPMOs组相比均有明显差异(P＜0.05）; DOX-HPMOs+HIFU组的瘤重抑瘤率为72.88％，而单纯HIFU组以及DOX-HPMOs组分别为34.14％和59.11％，DOX-HPMOs+HIFU组与单纯HIFU组以及DOX-HPMOs组相比均有明显差异（P＜0.05）。TUNEL染色后的组织学观察以及肿瘤组织光镜检查表明:对照组肿瘤细胞生长良好。单纯HIFU组和单纯DOX-HPMOs组肿瘤组织内可见少许坏死组织及相间分布的癌组织。DOX-HPMOs加HIFU组肿瘤坏死组织增加，坏死细胞轮廓消失，结构不清，可见核固缩、核碎裂及凋亡小体形成。
　　结论:HIFU联合DOX-HPMOs综合治疗ICR小白鼠S-180肉瘤的效果明显。
　　综上所述，HIFU介导的载药超声造影剂肿瘤综合诊治体系将成为目前一项具有挑战性的研究——其同时具有HIFU激发的药物控释和HIFU增效剂的功能。

目录

本论文专用术语注释表

摘要

第一部分 载药有序介孔有机硅造影剂用于高效的超声影像、超声辐照的药物控释和辅助肿瘤化疗

第一章 HPMOs的制备、理化性质及药物负载实验

第二章 HPMOs作为超声造影剂在体外的超声成像研究

第三章 超声辐照PTX-HPMOs体外药物释放动力学研究

第四章 超声辐照PTX-HPMOs对人宫颈癌Hela细胞作用的实验研究

第五章 超声辐照PTX-HPMOs对裸鼠移植瘤作用的实验研究

第六章 HPMOs作为超声造影剂在裸鼠体内的超声成像研究

第一部分 小结

第二部分 载药有序介孔有机硅造影剂在HIFU肿瘤综合诊治体系中的应用探索

第一章 HPMOs负载抗癌药物阿霉素的研究

第二章 HIFU介导DOX-HPMOs体外药物释放动力学研究

第三章 DOX-HPMOs细胞内的摄取实验

第四章 HPMOs在离体脱气牛肝组织中的HIFU增效实验

第五章 HIFU联合DOX-HPMOs治疗ICR小鼠S-180肉瘤的疗效实验

第六章 HIFU联合DOX-HPMOs治疗ICR小鼠S-180肉瘤后肿瘤坏死及凋亡研究

第二部分 小结

全文总结

综述1 超声分子成像技术定量评估肿瘤微血管生成的研究进展

综述2 超声介导携药微泡诊疗应用研究进展

参考文献

一、在校期间学术交流情况

二、在校期间论文发表情况

致谢

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