SIRT1-p53、cAMP/CREB信号通路参与老年大鼠吸入麻醉致学习与记忆损害的机制研究

摘要

本课题共分为以下三部分:
　　第一部分 七氟醚联合氧化亚氮吸入麻醉对老年大鼠学习与记忆功能的影响
　　目的:探索1.3％ Sev联合50％ N2O吸入麻醉4h后对老年大鼠学习与记忆的影响。
　　方法:18月龄SD大鼠随机分为麻醉组和对照组，麻醉组给予1.3％Sev+50％N2O吸入4h，对照组给予50％O2吸入4h。48h后进行Morris水迷宫实验，包括6天定航训练（day1-day6），定航训练结束后24小时即第7天进行第1次空间探索实验，第14天进行第2次空间探索实验。
　　结果:重复测量数据方差分析显示在定航训练期Sev+N2O麻醉组较对照组逃逸潜伏期明显延长(p=0.001)，训练后第2天(p=0.041)、第3天(p=0.003)、第5天(p=0.033)存在显著性差异。随着训练时间的渐进，两组逃逸潜伏期均随时间显著减少(p＜0.001)。定航训练期两组的游泳速度无明显差异(p=0.11)。第7天的空间探索实验则显示麻醉组在目标象限的游泳时间百分比和路程百分比均显著小于对照组(p=0.022，p=0.009)，提示七氟醚联合氧化亚氮吸入麻醉4h致老年大鼠学习与记忆功能损害。而第14天空间探索实验结果则显示两组在目标象限的时间百分比和路程百分比已无明显差异。
　　结论:七氟醚联合氧化亚氮吸入麻醉4h可导致老年大鼠短期学习与记忆功能损害。
　　第二部分 SIRT1-p53信号通路参与老年大鼠七氟醚联合化亚氮吸入全麻后致学习记忆损害的机制研究
　　目的:Silent information regulator1(SIRT1)是第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶sirtuin家族中的一员，在大脑内广泛表达并介导神经元内多种重要的细胞内反应，如促进细胞存活、增强DNA损伤后的修复以及减少细胞分化。本研究探讨老年大鼠吸入麻醉后海马区SIRT1-p53信号通路的变化、SIRT1在吸入麻醉致神经毒性中的作用以及SIRT1激动剂白藜芦醇（resveratrol）预处理的影响及其神经保护作用。
　　方法:1）1.3％Sev+50％N2O吸入麻醉后48小时及空间探索实验结束后大鼠断头取脑，通过Western Blot以及免疫组化染色检测海马区凋亡相关指标cleavedcaspase-3、Bax等的表达，以及SIRT1、乙酰化的p53的表达;2）采用出生24h内的新生大鼠进行海马原代神经元细胞培养，培养14天后给予SIRT1抑制剂sirtinol、salermide及resveratrol或相同容积DMSO共培养24小时后再进行吸入麻醉处理2h，Western Blot以及免疫组化染色检测凋亡相关指标cleaved caspase-3、Bax等的表达，以及SIRT1，乙酰化的p53的表达;3）给予老年大鼠每天腹腔注射白藜芦醇100mg/kg或对照剂，连续处理7天，第7天予以1.3％Sev+50％N2O吸入麻醉4h，48h后进行Morris水迷宫实验。吸入麻醉后48h及空间探索实验结束后大鼠断头取脑，检测海马区凋亡相关指标及SIRT1、乙酰化p53的表达情况。
　　结果:1）吸入麻醉后48h及第7天空间探索实验结束后麻醉组海马区内细胞凋亡相关指标cleaved caspase-3、Bax的表达明显较对照组升高，同时NeuN/TUNEL双标结果也提示麻醉组海马区内的细胞凋亡与神经元丢失增加。伴随着细胞凋亡的增加，麻醉组海马区内源性SIRT1的表达及p53的去乙酰化也增加。第14天空间探索实验结束后cleaved caspase-3、Bax的表达两组已无显著性差异，而麻醉组SIRT1也稍下降;2）在细胞体外实验中，resveratrol预处理海马原代神经元细胞后内源性SIRT1的表达进一步升高，乙酰化的p53表达则相应降低，同时凋亡指标cleaved caspase-3、Bax以及DNA损伤指标PARP-1、γH2AX的表达则明显降低，提示SIRT1可抑制挥发性麻醉药所致神经毒性起到神经保护作用。sirtinol、salermide则抑制SIRT1的表达及p53的乙酰化，凋亡指标cleavedcaspase-3、Bax以及DNA损伤指标PARP-1、γH2AX的表达则较对照组明显升高;3）水迷宫实验结果显示resveratrol处理组在定航训练期较单纯麻醉组潜伏期明显缩短(p=0.013)，分别在训练的第3天(p=0.020)、第4天(p=0.049)和第6天(p=0.044)出现显著性差异。训练期两组大鼠游泳速度无明显差异(p=0.912)。空间探索实验中两组目标象限时间百分比和路程百分比均无显著性差异。吸入麻醉后48h及空间探索实验结束后Western Blot及免疫组织化学染色结果均显示resveratrol处理组cleaved caspase-3，Bax等的表达较对照组均明显降低，而SIRT1的表达则升高，且p53乙酰化降低。
　　结论:体内与体外实验结果显示七氟醚联合氧化亚氮暴露后导致神经元细胞凋亡及内源性SIRT1的表达及p53去乙酰化增加。给予SIRT1激动剂resveratrol预处理后，能提高神经元存活能力并能一定程度对抗吸入麻醉所致神经毒性从而起到神经保护作用。
　　第三部分 cAMP/CREB信号通路与七氟醚联合氧化亚氮吸入麻醉后致学习记忆损害相关
　　目的:cAMP反应结合蛋白(cyclic AMP response element-binding proteinCREB)与学习记忆、长时程增强（long term potentiation，LTP）以及神经保护具有高度相关性。CREB通过cyclic AMP(cAMP)或者Ca2+依赖的蛋白激酶催化丝氨酸133位点磷酸化为pCREB，后者对长期记忆的巩固具有重要作用，并调节细胞凋亡及神经再生过程。本部分的研究探讨海马区cAMP/CREB-神经细胞凋亡/神经再生与吸入麻醉致认知功能障碍的关系
　　方法:1.3％Sev+50％N2O吸入麻醉后48h及第7天空间探索实验结束后ELISA检测海马区cAMP的表达，Western Blot、免疫荧光检测pCREB/CREB表达，以及神经再生标志物Nestin和DCX的表达。NeuN/AnnexinⅤ双染检测海马区神经凋亡，尼氏染色计数海马区功能神经元数。
　　结果:吸入麻醉后48h及第7天空间探索实验结束后麻醉组海马区cAMP及pCREB的表达较对照组均降低，而CREB的表达在两个时间点均无明显差异。尼氏染色发现吸入麻醉后48h及空间探索实验结束后麻醉组海马CA1区尼氏染色阳性细胞计数均较相应的对照组降低，且神经元标记物NeuN的表达降低。而AnnexinⅤ/NeuN双染结果显示两个时间节点的麻醉组AnnexinⅤ表达阳性的细胞数明显多于相应的对照组，且AnnexinⅤ阳性的细胞大部分同时NeuN表达阳性，表明发生细胞凋亡的细胞类型多为海马区神经元。Western Blot检测Bax表达结果显示吸入麻醉后48h麻醉组Bax的表达较对照组明显升高，空间探索实验结束后麻醉组Bax的表达仅稍高于对照组，提示可能存在Bax依赖的细胞凋亡途径。麻醉组海马齿状回区(dentategyms，DG)神经元祖细胞特异标记物nestin及未成熟神经元标记物DCX的表达较对照组均显著降低，提示神经元祖细胞增殖与分化受到抑制。
　　结论:cAMP/CREB信号通路下调、神经元凋亡增加及海马区神经再生能力下降可能与七氟醚联合氧化亚氮吸入麻醉所致神经毒性及认知功能下降相关。

目录

缩略词表

摘要

引言

第一部分 七氟醚联合氧化亚氮吸入麻醉对老年大鼠学习与记忆功能的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分 SIRT1-p53信号通路参与七氟醚联合氧化亚氮吸入麻醉致学习记忆损害的机制研究

前言

第一节 SIRT1-p53信号通路参与吸入麻醉致学习记忆障碍的机制探讨

材料与方法

结果

讨论

小结

第二节 SRIT1激动剂白藜芦醇对老年大鼠吸入麻醉后的神经保护作用研究

材料与方法

结果

讨论

小结

第三部分 cAMP／CREB信号通路与七氟圈匿联合氧化亚氮吸入麻醉后致学习记忆损害相关

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

全文总结

参考文献

综述 吸入麻醉药对老年大鼠认知功能的影响及其机制的研究进展

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