上海地区小鼠诺瓦克病毒的感染状况及病毒的分离和表达

摘要

小鼠诺瓦克病毒(Murine Noroviruses，MNV)属于杯状病毒科，诺如病毒属，在实验小鼠中的自然感染率很高，最初是在免疫缺陷小鼠内发现的。感染MNV后，免疫功能正常的小鼠通常无明显症状，而免疫缺陷小鼠可以出现致死性感染。MNV具有遗传和抗原多样性，容易发生变异，我国关于MNV的报道还比较少，对其致病力及对实验研究的影响尚不完全清楚，也没有明确的感染情况调查。
　　为了解上海地区实验小鼠自然感染MNV的状况，本实验抽取委托检测单位送检的319只SPF级实验小鼠，分别采集盲肠内容物和血清样本，应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增小鼠盲肠内容物样本中MNV的特异性基因片段来检测MNV的感染状况，同时采用酶联免疫吸附试验(Enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)与核酸检测方法进行对比。MNV可以在小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞内进行复制，并能产生细胞病变效应(Cytopathic effect，CPE)，利用这个特性，可以将RT-PCR检测结果为阳性的盲肠内容物样本稀释后经0.22μm滤膜过滤，将滤液接种到RAW264.7细胞分离病毒，盲传后采用RT-PCR方法鉴定。MNV是RNA病毒，基因组含有四个开放阅读框(Open readingframes，ORFs)，其中的ORF2编码衣壳蛋白VP1，而目前关于MNV的研究多与VP1有关，根据GenBank中登陆的国内广州株序列设计相关引物，扩增分离毒株的ORF2，并进行克隆、原核表达，观察是否有诱导蛋白产生。
　　经RT-PCR检测的319份小鼠盲肠内容物样本中，阳性样本95份，阳性率为29.78％。对180份经RT-PCR检测的小鼠的血清样本进行ELISA检测，阳性样本70份，阳性率为38.89％。RAW264.7细胞盲传5代后在24h内出现CPE，72h内病变逐渐明显，细胞培养物经RT-PCR鉴定，凝胶电泳得到一条187bp的目的条带，测序结果与样本来源一致。
　　经RT-PCR扩增得到分离毒株的ORF2片段，测序结果为1626bp，经NCBI的BLAST软件分析，与登录的MNV毒株同源性在87％以上。为得到大量稳定的目的片段，将ORF2克隆到pMD-18T载体。目的质粒与表达载体pET28a双酶切后连接，将重组质粒pET28a-ORF2转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导蛋白表达、镍琼脂糖亲和层析和阴离子交换层析分离纯化目的蛋白，通过SDS-PAGE电泳判断目的蛋白分子质量约60 KD。
　　本实验通过核酸检测方法和血清学方法证实上海地区实验小鼠存在MNV自然感染，且感染率较高，利用细胞培养分离到阳性毒株，并对分离毒株的ORF2进行了原核表达，小鼠作为常用的实验动物，应该严格控制其质量，避免小鼠本身存在的病原体干扰实验结果，所以应加强实验小鼠的饲养管理。

目录

英文缩略词表

摘要

前言

第一部分 两种方法对上海地区小鼠诺瓦克病毒的检测分析

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

第二部分 细胞培养及病毒分离

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

第三部分 ORF2的克隆及原核表达

一、材料

二、方法

三、结果

四、讨论

本文小结

参考文献

文献综述 小鼠诺瓦克病毒的研究进展

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢

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