组织因子途径抑制物2的减少对动脉粥样硬化斑块稳定性影响的临床及基础研究

摘要

背景:
　　动脉粥样硬化疾病已成为威胁国人健康的主要疾病之一，动脉粥样硬化(atherosclerosis， AS)斑块不稳定是导致不稳定性心绞痛，急性心肌梗死，心源性猝死等冠心病临床急症的根本原因。目前主要的假说认为发病时动脉粥样硬化的斑块发生破裂，暴露了内膜下的致凝成分和脂质核心，进而形成局部血栓导致冠脉急性供血不足，导致急性冠脉综合征的发生。动脉粥样硬化斑块稳定性主要决定于斑块纤维帽的完整性，斑块纤维帽的完整性则主要与细胞外基质(extracellar matrix， ECM)合成与降解的动态平衡有关。基质金属蛋白酶(MMPs)是调控ECM合成与降解动态平衡的重要酶系，与粥样硬化斑块不稳定息息相关。
　　组织因子途径抑制物2(tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2)属Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制物家族蛋白，主要分布于内皮细胞和成纤维细胞的细胞外基质(ECM)和胎盘合胞体滋养层中。TFPI-2为MMPs活性的内源性抑制物，在维持和调控细胞外基质重塑方面，起到关键的作用。一方面TFPI-2可以先于其它蛋白酶抑制剂直接抑制MMP的活性;另一方面，通过抑制纤溶酶和胰蛋白酶，阻止ECM中的基质金属蛋白酶原(proMMPs)活化为MMPs，间接调控MMPs活性。
　　我们前期的临床研究提示TFPI-2在急性冠脉综合征患者外周血中水平较低，且在动物预实验中发现易损斑块肩部TFPI-2表达量低，并与MMPs呈负相关，我们推测TFPI-2的表达不足可能是动脉粥样硬化斑块发生发展的病理生理基础之一。以此为研究切入点，我们设计从临床和基础两方面来探讨TFPI-2水平减低和动脉粥样斑块稳定性的关系，并试图阐明其机制。
　　第一部分、组织因子途径抑制物2基因多态性与急性冠脉综合征关联性的临床研究
　　目的:在中国汉族人群中检测TFPI-2基因是否存在基因多态性，并探讨其与冠心病、急性冠脉综合征的相关性。
　　方法:采用病例对照研究设计，选择急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)患者140例，其中包括不稳定型心绞痛患者(unstable angina，UA)68例、急性心肌梗死患者(acute myocardium infarction，AMI)72例;稳定型心绞痛患者(stableangina，SA)273例，以及正常对照306例。采用聚合酶链反应产物直接测序的方法对所有纳入对象进行TFPI-2基因多态性分析和关联分析。采用SPSS19.0软件统计分析结果。
　　结果：本研究共入选719例，其中ACS组140例（包括不稳定型心绞痛68例和急性心肌梗死72例）;稳定型心绞痛组273例;正常对照组306例。在所有对象的TFPI-2基因中共检测出8个单核苷酸多态性位点，分别是rs3763473，rs59805398, rs60215632, rs59999573, rs59740167, rs34489123, rs4517,rs4264。其中rs59805398位点C等位基因在ACS组与对照组间差异有统计学意义(p=0.0001;p＜0.05);另外和rs34489123位点G等位基因在ACS组与对照组间差异有统计学意义(p=0.015; p＜0.05)。而SA组与对照组比较;rs59805398位点等位基因C的频率组间差异有统计学意义(p=0.0001; p＜0.05)，rs34489123位点等位基因G的频率组间差异有统计学意义(p=0.0001; p＜0.05)。rs3763473，rs59999573，rs59740167，rs34489123四个位点在ACS组中存在连锁不平衡，与rs59805398位点关联分析提示主要有C-C-G-G-G和T-C-G-G-G两种单倍型。rs59999573，rs59740167，rs34489123位点在SA组中存在连锁不平衡，与rs59805398位点进行关联分析，主要有C-G-G-G和G-A-A-A两种单倍型。ACS组与SA组之间均未见明显差异。
　　结论：本研究发现TFPI-2基因外显子及两端非编码区存在8个SNP位点，其中rs59805398位点等位基因C和rs34489123位点等位基因G与ACS和SA发病有密切关联，是冠心病的发病可能的风险因子。
　　第二部分、下调组织因子途径抑制物2对动脉粥样硬化斑块稳定性影响的实验研究
　　一、血管内皮细胞条件性TFPI-2基因敲除小鼠模型的建立
　　目的：构建血管内皮细胞TFPI-2条件性基因敲除小鼠模型，为研究TFPI-2与动脉粥样硬化的关系提供实验模型。
　　方法：通过组织特异性定点重组Cre/LoxP系统构建血管内皮细胞条件性TFPI-2敲除的小鼠模型，剪鼠尾抽提基因组，PCR法鉴定小鼠基因型。共得到TFPI-2-/+/Tek-cre小鼠6只作为实验组，对照组为同背景C57小鼠、ApoE-/-小鼠各6只;三组小鼠每隔2周采血200ul离心分离血清测TFPI-2表达量，饲养至20周后处死取主动脉血管组织用western blot方法检测血管TFPI-2表达量，验证基因敲除效率。
　　结果：成功制备血管内皮条件性TFPI-2敲除的小鼠模型6只，基因型为TFPI-2fl/-/Tek，该组小鼠血清TFPI-2水平约300-400pg/ml左右，明显低于C57BL/6J组和ApoE-/-组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，Western blot检测血管TFPI-2表达水平，TFPI-2-/+组小鼠血管组织TFPI-2表达量较ApoE-/-组低，较C57组明显减少;C57组小鼠血管TFPI-2水平高于ApoE-/-组。
　　结论：血管内皮条件性TFPI-2基因敲除小鼠模型制备成功。
　　二、血管内皮细胞条件性TFPI-2基因敲除对小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性的影响
　　目的：采用高脂饮食饲养的方法诱导血管内皮细胞TFPI-2条件性基因敲除小鼠发生动脉粥样硬化，分析其动脉粥样硬化斑块稳定性形态学指标的变化。
　　方法：将4-6周龄ApoE-/-小鼠、C57小鼠、TFPI-2fl/-/Tek小鼠各6只，分为三组，将上述模型利用高脂饮食饲养，制备TFPI-2fl/-/Tek小鼠动脉粥样硬化模型。20周龄后处死小鼠，截取主动脉斑块组织切片，HE染色，弹力纤维染色检测斑块不稳定性形态学指标，明确TFPI-2基因条件性敲除后对AS不稳定斑块的影响。
　　结果：三组小鼠体重未见明显差异，20周ApoE-/-组小鼠、TFPI-2-/+组小鼠与C57BL6J组小鼠血脂比较，TFPI-2-/+组小鼠、C57BL6J组小鼠的TC，TG和LDL-C，HDL-C水平显著低于ApoE-/-组(p＜0.05);而TFPI-2-/+组小鼠与C57BL6J组比较，血脂水平未见明显差异(p＞0.05)，动脉粥样硬化模型造模成功。斑块稳定性分析提示:TFPI-2+/-组和ApoE-/-组在管腔表面积、斑块表面积、脂质核心表面积、纤维帽层数和斑块破裂数量明显高于C57BL/6J组(P＜0.05);而纤维帽厚度则低于C57BL/6J组(P＜0.05);同时，TFPI-2+/-组而较ApoE-/-组斑块表面积、脂质核心表面积、纤维帽层数和斑块破裂数量较低，纤维帽厚度略高(P＜0.05)，因此TFPI-2+/-组斑块稳定性比ApoE-/-组高，却低于C57BL/6J组。
　　结论：与ApoE-/-组比较，下调血管内皮细胞TFPI-2基因表达水平能够增加动脉粥样硬化斑块的不稳定性。
　　三、TFPI-2水平下调对小鼠动脉粥样硬化斑块不稳定影响的机制初探
　　目的：血管内皮细胞TFPI-2条件性基因敲除小鼠经诱导后发生动脉粥样硬化，其动脉粥样硬化斑块稳定性介于ApoE-/-小鼠与C57BL6J小鼠之间，通过免疫组化检测斑块MMPs表达量和TFPI-2水平，结合western blot，探讨TFPI-2基因下调对斑块不稳定性的影响机制。
　　方法：利用上述分组动物的主动脉标本，通过免疫组化染色检测MMPs家族（MMP-2，MMP-9）的表达水平;同时采用Westernblot检测斑块组织中3条与斑块稳定性密切相关的NF-κB、PPAR-γ及PI3Kγ/PKB通路激活水平。
　　结果：TFPI-2-/+组的TFPI-2在AS斑块中的平均光密度值为992±72，明显低于ApoE-/-组1336±171和C57BL/6J组1609±210，具有统计学差异(P＜0.05);ApoE-/-组TFPI-2水平低于C57BL/6J组，具有统计学差异(P＜0.05);同时，TFPI-2-/+组的MMP-2在AS斑块中的平均光密度值为13260±1844，明显高于ApoE-/-组10385±1183和C57BL/6J组10087±1344(P＜0.05)，TFPI-2-/+组的MMP-9在AS斑块中的平均光密度值为11098±1186，明显高于ApoE-/-组9048±952和C57BL/6J组9184±1297(P＜0.05)。Western blot提示TFPI-2水平下调后，斑块组织中PPAR-γ磷酸化水平较ApoE-/-组和C57BL/6J组明显下降，而PI3Kγ/PKB、NF-κ B通路活性变化不明显。提示TFPI-2水平的下调对PPAR-γ通路具有抑制作用。
　　结论：小鼠血管内皮细胞内TFPI-2水平下调增加动脉粥样硬化斑块的不稳定性作用机制可能与其对MMP-2，9抑制减弱、并且抑制PPAR-γ通路激活相关。

目录

主要缩略词

摘要

引言

第一部分 组织因子途径抑制物2基因多态性与急性冠脉综合征关联性的临床研究

一 目的

二 材料与方法

三，结果

四 讨论

第二部分 下调组织因子途径抑制物2表达对动脉粥样硬化斑块稳定性影响的实验研究

(一)血管内皮细胞TFPI-2基因条件性敲除小鼠模型的建立

一、目的

二，材料与方法

三，结果

(二)、血管内皮细胞条件性TFPI-2基因敲除对小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性的影响

一、目的

二，材料与方法

三、结果

(三)、TFPI-2水平下调对小鼠动脉粥样硬化不稳定斑块的作用机制探讨

一、目的

二，材料与方法

三、结果

四、讨论

总结

参考文献

课题综述：动脉粥样硬化不稳定斑块相关标志物的研究进展

致谢

附录：在读期间已公开发表的文章

声明