毛细管电泳在多肽药物有关物质分析中的应用研究

摘要

多肽药物具有生物活性强、疗效好、毒副作用低、用量少等特点，现已成为药物研发的热点。多肽药物在合成及贮存过程中会产生一些杂肽，包括非对映异构体、乙酰化产物、去甲酰胺产物等。这些杂质影响产品的质量与安全，需要采用合适的方法对其进行监测。毛细管电泳具有分析速度快、分离效率高、样品用量少、消耗少、操作简便、分离模式多等优点，已成为分离蛋白多肽药物尤其是结构相似的蛋白多肽的强有力的手段。本论文主要以艾塞那肽和戈舍瑞林为研究对象，对毛细管电泳在多肽药物有关物质分析中的应用进行研究，结果表明毛细管电泳在多肽药物有关物质分析中具有潜在的应用价值。本论文实验主要由三大部分组成：
　　1.毛细管区带电泳法测定艾塞那肽纯度及其在稳定性研究中的初步应用。
　　实验建立毛细管区带电泳法测定艾塞那肽纯度，并将其应用于艾塞那肽稳定性研究。实验采用未涂层熔融石英毛细管（48.5 cm×50μm，有效长度40 cm），从运行缓冲液pH及浓度、分离电压、温度多个角度进行优化，并加入乙腈添加剂改善柱效和分离度。最终确立电泳条件为：运行缓冲液为200 mmol·L-1磷酸二氢钠－磷酸氢二钠溶液（pH6.2；含15％乙腈），分离电压为20 kV，温度25℃，检测波长214 nm，压力进样5 kPa×10 s。结果表明艾塞那肽在0.05～4.0 mg·mL-1（r=0.9999）范围内线性关系良好；检测限为3.3μg·mL-1，定量限为8.0μg·mL-1；主峰迁移时间与纯度的日内、日间精密度均小于2.0%。该方法与HPLC法比较，纯度测定结果基本一致，本法分离效果更好，分析时间缩短，能有效检查艾塞那肽的纯度。该方法可用于艾塞那肽的质量控制和稳定性研究。
　　2.胶束电动毛细管色谱法测定戈舍瑞林有关物质。
　　实验建立胶束电动毛细管色谱法对戈舍瑞林有关物质进行分析，成功将戈舍瑞林及结构相似的8种有关物质进行分离。在胶束电动毛细管色谱中，使用了新的添加剂组合（CTAB、β-CD和己烷磺酸钠）来改善分离效率，将胶束、环糊精以及离子对试剂与分析物综合作用，相互竞争制约，使各分析物都获得较好的分离效果。实验采用未涂层熔融石英毛细管（48.5 cm×50μm，有效长度40 cm），对影响分离效率的因素如表面活性剂、添加剂（环糊精、己烷磺酸钠）、缓冲液pH及浓度、仪器参数（温度、电压）进行优化，确定电泳条件为：运行缓冲液为200 mmol·L-1 EACA溶液，含175 mmol·L-1 CTAB，3.0%w/vβ-CD，20 mmol·L-1己烷磺酸钠，用乙酸调pH4.2；运行电压-10 kV，温度20℃；压力进样5 kPa×10 s；检测波长220 nm。该方法专属性好，准确度高，重复性好，可以满足戈舍瑞林有关物质检测的要求。与RP-HPLC法相比，该方法解决杂质混合峰问题，且分析时间短。实验还对戈舍瑞林稳定性进行了表征，了解其杂质变化情况，为药物的进一步研究提供参考。
　　3.毛细管电泳对促黄体素释放激素类似物的分离研究。
　　实验以结构相似的四种LHRH类似物（阿拉瑞林、亮丙瑞林、戈舍瑞林及曲普瑞林）为模型分析物，建立了CE法对其进行分离。重点考察环糊精、表面活性剂、有机溶剂等添加剂对分离效果的影响，为结构相似肽的分离及多肽药物有关物质的分析提供参考。实验通过添加γ-CD改善分离效果，在毛细管区带电泳模式下使四种LHRH类似物得到很好分离；同时还使用表面活性剂，在胶束电动毛细管色谱模式下进行分离。其中CTAB体系方法简便，分离效果好，分析速度快；CHAPS体系通过加入有机溶剂也实现了四种LHRH类似物的分离。实验显示毛细管电泳在分离结构相似多肽方面具有独特的优势，为多肽的质量研究提供了一种有效的分析手段。

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符号说明

1 前言

1.1 多肽药物

1.2 毛细管电泳条件优化策略

1.3 本论文的研究内容及创新点

2 毛细管区带电泳法测定艾塞那肽纯度及其在稳定性研究中的初步应用

2.1 概述

2.2 实验部分

2.3 电泳条件优化

2.4 方法学考察

2.5 应用

2.6 结论

3 胶束电动毛细管色谱法测定戈舍瑞林有关物质

3.1 概述

3.2 实验部分

3.3 电泳条件优化

3.4 方法学验证

3.5 应用

3.6 结论

4 毛细管电泳对促黄体素释放激素类似物的分离研究

4.1 概述

4.2 实验部分

4.3 方法开发

4.4 结论

5 全文结论

参考文献

致谢

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