代谢基因FH和SDH突变导致代谢失衡调控表观遗传相关分子机制研究

摘要

IDH1和IDH2是人类肿瘤中发生突变频率最高的代谢酶基因，IDH1和IDH2突变可以减少α-KG的产生并同时积累致癌代谢物2-HG。2-HG作为α-KG的竞争性抑制剂，抑制α-KG依赖型双加氧酶活性，包括组蛋白去甲基化酶和TET家族5甲基胞嘧啶羟化酶，从而引起全基因组内的组蛋白和DNA甲基化水平的改变。除IDH1和IDH2外，其他两种三羧酸循环中的代谢酶基因FH和SDH也在许多类型肿瘤中发生突变。FH和SDH突变可以导致其相对应产物，即Fumarate和Succiante的异常累积。在本文中，我们阐述了Fumarate和Succinate与α-KG结构类似，亦也作为α-KG的竞争性抑制剂，影响α-KG依赖型双加氧酶活性，包括组蛋白去甲基化酶，脯氨酰羟化酶，胶原脯氨酰4-羟化酶以及TET家族5甲基胞嘧啶羟化酶等。运用RNAi干扰技术，特异性敲低小鼠肝脏中Fh和Sdh基因，可以分别引起小鼠肝脏内Fumarate和Succinate浓度的升高，抑制细胞内α-KG依赖型双加氧酶的活性，从而改变全基因组内组蛋白和DNA甲基化程度。此外，在体外培养细胞中过量表达在肿瘤中发现的FH和SDH突变体，也可以引起细胞内Fumarate和Succinate浓度的升高，抑制细胞内多种α-KG依赖型双加氧酶的活性，从而改变全基因组内组蛋白和DNA甲基化程度。这些表观遗传状态的改变，通过调控下游基因转录，可能影响前体细胞增殖和分化，从而促进肿瘤发生。
　　TET家族双加氧酶可以催化5-甲基胞嘧啶(5mC)的氧化生成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，从而进一步通过不同途径实现被动去甲基化或主动去甲基化。然而，TET蛋白是如何被募集到基因组特定区域的，至今尚不清楚。在本文中，我们阐述了WT1，一个参与发育调控的序列特异性锌指转录因子，可以把TET2募集到基因组的特定位置，实现该特定区域的DNA羟甲基化，从而激活WT1下游基因表达。更为重要的是，在急性髓性白血病AML中发生的TET2突变可以有效阻断TET2与WT1之间的结合，这一发现为揭示在急性髓性白血病AML中WT1和TET2基因存在互斥突变的现象，提供了有力的实验数据支持。

目录

摘要

第一章 前言

1．研究背景

1．1 三羧酸循环的重要性

1．2 线粒体功能缺失与肿瘤生成

1．3 表观遗传的调控与肿瘤生成

2．代谢基因突变与肿瘤发生

2．1 异柠檬酸脱氢酶IDH

2．2 延胡索酸氢化酶FH

2．3 琥珀酸脱氢酶SDH

2．4 代谢产物对表观遗传调控的展望

3．TET2蛋白调控表观遗传和基因表达相关分子机制

3．1 TET家族5-甲基胞嘧啶羟化酶

3．2 WT1转录因子

3．3 TET2通过结合WT1对靶基因表达进行调控

第二章 代谢基因FH和SDH突变引起代谢失衡调控表观遗传

1．研究背景

2．材料试剂

2．1 细胞培养用缓冲液

2．2 细胞转染用缓冲液及试剂

2．3 细胞裂解用缓冲液

2．4 蛋白电泳用缓冲液

2．5 细菌培养用试剂及缓冲液

2．6 分子克隆用试剂

2．7 其他试剂

3．仪器设备

4．实验方法

4．1 组蛋白去甲基酶的酶活测定

4．2 GC-MS方法测定细胞内代谢物浓度

4．3 FH和SDH knock-down实验

4．4 TET催化细胞内5mC转化为5hmC检测

4．5 细胞的培养和转染

4．6 免疫组化

4．7 细胞可渗透性的α-KG、Succinate和Fumarate的合成

4．8 荧光定量实时PCR

4．9 免疫荧光实验

4．10 免疫印迹(Western Blot)

4．11 定点突变实验

4．12 SDH酶活的测定

4．13 FH酶活的测定

4．14 Dot-blot检测细胞基因组DNA中5hmC的水平

5．实验结果

5．1 肿瘤相关IDH1／2突变引起细胞内α-KG浓度的降低，2-HG的累积

5．2 2-HG可以抑制以α-KG为底物的组蛋白去甲基化酶活性

5．3 Fumarate和Succinate可以抑制以α-KG为底物的KDM活性

5．4 Fumarate和Succinate会引起组蛋白甲基化水平的上升

5．5 Fumarate和Succinate可以抑制以细胞内α-KG为底物的双加氧酶PHDs

5．6 Fumarate、Succinate和α-KG的竞争性关系

5．7 FH和SDH knock-down减少细胞内TET催化的5hmC水平

5．8 在小鼠肝脏中抑制Fh和Sdh表达影响多种α-KG为底物的双加氧酶的活性及基因表达

5．9 肿瘤中发现的FH和SDH突变对α-KG为底物的双加氧酶活性的抑制

6．讨论

6．1 Fumarate、Succinate是α-KG的竞争性拮抗剂

6．2 Fumarate、Succinate与α-KG浓度的比例可能更为重要

6．3 Fumarate可以引起异常的琥珀酰化

7．小结

第三章 WT1募集TET2到特定基因启动子区域并调控基因表达

1．AML中基因突变研究背景

2．材料和试剂

3．实验方法

3．1 免疫沉淀／免疫共沉淀

3．2 TET2和WT1 knock-down实验

4．实验结果

4．1 WT1和TET2在AML中呈现互斥突变的现象

4．2 在293T细胞中过量表达WT1和TET2可以检测到二者相互结合

4．3 WT1和TET2在小鼠胚胎干细胞和骨髓细胞中相互结合

4．4 WT1和TET2结合的特定区域

4．5 AML中发生的TET2突变能阻断TET2与WT1的结合

4．6 转录因子IDAX与WT1竞争性结合

5．讨论

6．小结

参考文献

博士期间发表论文

致谢

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