猪、鸡脂肪代谢相关基因的分子特征及表观遗传调控

摘要

畜禽脂肪代谢受多种因素影响,包括遗传、营养、内分泌和环境等因素,它们在脂肪代谢中形成复杂的调控网络。脂类是动物和人体必需的营养成分,也是生物体重要的组成成分,但猪、鸡体内过多的脂肪沉积给人类带来一系列的问题。基于此,以猪、鸡为研究对象,本试验对影响脂肪代谢相关基因的分子特征和表观遗传调控进行了研究。利用分子生物学和生物信息学相结合的方法对猪BMAL1(pBMAL1)基因的分子特征进行分析,以便寻找影响猪脂肪代谢的主效基因,为猪的分子育种实践提供理论支持。分析不同剂量的甜菜碱对鸡部分生产性状和屠宰性状的作用,进而探讨甜菜碱对脂肪代谢相关基因表达和甲基化水平的影响,为进一步深入研究甜菜碱调控基因表达和甲基化的分子机理奠定基础,对于提高优质高产鸡的选育具有重要意义。 第一部分：以人和小鼠BMAL1基因序列设计简并引物成功克隆了猪BMAL1 cDNA和非编码区部分序列,分析了pBMAL1基因在不同部位脂肪组织和其它组织中的表达,并对其进行了精细定位。结果表明,pBMAL1基因序列长为2073bp,开放阅读框为1878bp,编码626个氨基酸,该氨基酸包括bHLH、PAS-A和PAS-B结构域。编码区核酸序列与人、小鼠和大鼠的同源性分别为94.36％,89.85％和89.79％；氨基酸序列与人、小鼠和大鼠的同源性分别为99.20％,98.24％和97.92％。在长白猪和莱芜猪背膘中发现了两个剪接变异体。pBMAL1 mRNA在长白猪5种脂肪组织均有表达,在肠系膜脂肪表达量最高,在花油表达量最低,但差异不显著(P>0.05);pBMAL1 mRNA在成年莱芜猪14种组织均有表达,在背膘中表达最高,在眼肌中表达最低。用辐射杂种板把pBMAL1基因定位在SSC 2p11-q21。 第二部分：通过在肉鸡和蛋鸡饲料中添加不同剂量的甜菜碱,研究甜菜碱对鸡部分生产性状和屠宰性状的影响；采用半定量RT-PCR方法分析了甜菜碱对脂肪代谢相关基因LPL、PPARγ、A-FABP、FAS、Adiponectin、BMAL1和CLOCK mRNA表达的影响,并通过亚硫酸盐测序的方法对LPL和PPARγ基因的启动子区甲基化进行了分析。 结果表明,在饲料中添加0.1％的甜菜碱对肉鸡平均日增重、腹脂率和肝重率作用不显著(P>0.05)。在饲料中添加0.08％的甜菜碱使165日龄蛋鸡的肝重率比对照组降低15.66％(P<0.05),使180日龄的日均产蛋率提高26.18％(P<0.05)。不同剂量的甜菜碱对其余性状在两个试验阶段各组之间影响均不显著(P>0.05)。 饲料中添加0.1％的甜菜碱分别使56日龄肉鸡脂肪中A-FABP mRNA和66日龄肉鸡脂肪中LPL mRNA表达丰度显著降低(P<0.05);使56和66日龄肉鸡脂肪中FAS mRNA的表达丰度极显著降低(P<0.01)。但是,同样剂量的甜菜碱对56日龄肉鸡脂肪中LPL,66日龄肉鸡脂肪中A-FABP,56和66日龄肉鸡脂肪中PPARγ、Adiponectin、BMAL1和CLOCK mRNA的表达丰度影响不明显(P>0.05)。对于蛋鸡半定量RT-PCR分析表明,LPL mRNA的表达量在180日龄时甜菜碱Ⅱ组(添加0.06％的甜菜碱)极显著低于对照组和甜菜碱Ⅲ组(添加0.08％的甜菜碱)(P<0.01);FAS mENA的表达量在180日龄时甜菜碱Ⅲ组均极显著大于其余3组；Adiponectin mRNA的表达量R在165 日龄时甜菜碱Ⅲ组显著大于对照组(P<0.05):BMAL1 mRNA的表达量在180日龄时甜菜碱Ⅲ组显著大于对照组(P<0.05)。其余基因的表达量在不同试验组和不同试验阶段差异均不显著(P>0.05)。 亚硫酸盐测序结果显示,66日龄肉鸡脂肪中LPL基因启动子区处于低甲基化状态；对照组和甜菜碱组总体甲基化比率分别为4.55％和2.77％。56日龄肉鸡脂肪中PPARγ基因5'上游调控区处于高甲基化状态,对照组和甜菜碱组总体甲基化比率分别为76.7％和71.7％。甜菜碱对肉鸡脂肪LPL基因和PPARγ基因甲基化调控作用不明显(P>0.05)。 与肉鸡相似,180日龄蛋鸡脂肪中LPL基因启动子区处于低甲基化状态,对照组、甜菜碱Ⅰ组(添加0.04％的甜菜碱)、甜菜碱Ⅱ组和甜菜碱Ⅲ组的总体甲基化比率分别为3.20％、4.31％、1.83％和3.65％,各组之间差异不显著(P>0.05)。PPARγ基因5'上游调控区处于高甲基化状态,对照组、甜菜碱Ⅰ组、甜菜碱Ⅱ组、甜菜碱Ⅲ组的总体甲基化比率分别为89.6％、85.7％、85.7％和71.2％,对照组与甜菜碱Ⅲ组相比差异显著(P<0.05)。

目录

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摘要

第一章猪BMAL1基因的特征：cDNA的克隆、表达和定位

1前言

1.1影响畜禽脂肪代谢的遗传和营养因素分析

1.2 BMAL1基因的分子生物学及功能

2本研究的目的和意义

3试验研究

3.1.材料与方法

3.2结果与分析

3.3讨论

3.4结论

第二章甜菜碱对鸡脂肪代谢相关基因表达的影响和表观遗传调控

1前言

1.1甜菜碱的作用及调控机理

1.2基因表达的表观遗传调控

2本研究的目的和意义

3试验研究

3.1材料与方法

3.2结果与分析

3.3讨论

3.4结论

参考文献

致谢