mTORC1相关基因功能性多态位点与前列腺癌易感性及预后关系的分子流行病学研究

摘要

前列腺癌是男性中最常见的恶性肿瘤之一，其发病具有显著的地区及种族差异。中国前列腺癌的发病率也有逐年升高的趋势。越来越多的证据表明，年龄、种族和家族史是目前公认的与前列腺癌发病相关的三大因素。前列腺癌的发生、发展可能是机体遗传易感性和环境因素相互作用的结果，而与此相关的遗传变异则决定个体罹患前列腺癌的易感性。迄今为止，在世界上不同种族人群中的全基因组关联性研究已经揭示了超过30个易感位点与前列腺癌的发生风险有关。以候选基因为策略的前列腺癌遗传易感性的研究也取得了丰硕的成果。目前认为，前列腺癌的发生、发展及其预后与遗传物质的多态性相关，而且这种相关性随着高危易感基因数目的增加而明显增高。研究还发现，尽管基因多态性与前列腺癌发病风险相关，但这种影响的效应度往往较低，且受环境因素的影响（包括内、外环境）。目前尚无经多中心验证的、较为可靠的与前列腺癌发病风险及预后相关的遗传多态位点。
　　PI3K/AKT/mTOR信号传导通路主要参与蛋白质的合成。近年来，国内外陆续有关该信号转导通路基因单核苷酸多态性与前列腺癌易感性关系的研究报道，但结果不尽一致。研究发现，该信号通路的活性主要与通路下游的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin complex1，mTORC1)的生物学活性相关，体内体外研究证实mTORC1的异常与癌症的发生相关，并且是雷帕霉素作用的靶点。因此，有理由认为该复合物相关基因的多态性位点与前列腺癌发病风险可能相关。mTORC1由一系列直接或间接作用于mTOR的关键分子共同组成，这些分子包括Raptor、mLST8、DEPTOR、PRAS40和mTOR。其中，Raptor与mLST8起正向调节mTOR的作用，而DEPTOR和PRAS40起负向调节mTOR的作用。本研究将以mTORC1相关基因为候选基因，结合mTOR分子mRNA及蛋白质的表达及下游靶基因p70S6K和4EBP1的表达，在前列腺癌细胞株和前列腺癌组织标本上进行系统性的研究，有助于发现mTORC1在中国人群中与前列腺癌发病风险有关的遗传易感位点，从而为揭示PI3K/AKT/mTOR信号通路相关基因多态性在前列腺发病中的作用提供可能的遗传学证据，并为前列腺癌术后生化复发的预测提供可能的新的生物学标记。
　　第一部分 mTORC1相关基因遗传多态性与前列腺癌易感性的关联性研究
　　为了研究mTORC1相关基因的、具有潜在功能性的SNPs与前列腺癌发病风险的关联性，我们在中国华东地区汉族人群中选择1015例前列腺癌病例和1093例健康男性，开展以医院为基础的病例-对照关联性研究，并采用Taqman探针方法对SNPs进行基因分型检测，运用SAS9.1.3软件包进行统计学描述及关联分析。结果发现，病例组以进展期前列腺癌为主，其中PSA大于20ng/ml的患者占54.4％，小于10ng/ml的患者占17.7％;而Gleason分级≤7(3+4)的患者占31.2％，≥7(3+4)的患者占59.7％;临床分期Ⅰ+Ⅱ期患者占43.3％，Ⅲ+Ⅳ期患者占49.1％。本研究共检测了mTORC1中5个基因的16个SNP位点，结果表明mTOR-rs2536[加性模型:1.34(1.08-1.66)，P=0.008;显性模型:1.42(1.13-1.78)，P=0.003]，mTOR-rs1034528[加性模型:1.21(1.03-1.42)，P=0.019;显性模型:1.29(1.07-1.55)，P=0.007]，mTOR-rs2295080[加性模型:0.80(0.69-0.94)，P=0.005;显性模型:0.76(0.64-0.92)，P=0.003]，及RPTOR-rs1062935[加性模型:1.14(1.01-1.29)，P=0.0341;显性模型:1.28(1.06-1.56)，P=0.0127]与前列腺癌的发病风险显著关联。而亚组分析的结果也表明，mTORC1中mTOR-rs536，-134528，-2295080，以及RPTOR-rs1062935与前列腺癌的发病风险相关，而患前列腺癌的风险也随着复合物中相关风险基因数量的增加而明显提高。本研究中的基因内多位点单倍体分析、基因内多位点联合效应分析、以及基因间的联合效应分析中都发现与前列腺癌发病风险的关联性。在logistic显性模型中我们发现随着风险基因型数目的增加，患前列腺癌的风险也逐渐提高，这种等位基因剂量相关的效应在mTOR多位点的联合分析中显示明显的前列腺癌发病关联性，在小于69岁，BMI体重指数小于24kg/m2，曾经吸烟，Gleason评分≤7(3+4)，和临床分期Ⅲ+Ⅳ的人群中尤其明显。在进一步的交互作用分析中，我们发现BMI和mTOR-rs2536(P=0.0031),BMI和AKT1S1-rs2290774(P=0.0496)，以及DEPTOR-rs4871827与RPTOR-rs1062935(P=0.0224)之间在前列腺癌发病方面均存在交互作用。
　　综上所述，本研究运用较大的样本量分析了mTORC1中SNPs与前列腺癌发病风险的关连性，并获得了有价值的信息。但是本研究还是存在一些局限性。尚需要多中心、更大样本量及设计更加合理的研究来证实我们的研究结果。
　　第二部分 mTOR基因3，非编码区阳性关联位点的功能学研究
　　在第一部分的关联性研究中，我们发现多态位点mTOR-rs2536，-rs1034528，-rs2295080，和RPTOR-rs1062935与前列腺癌的发病风险关联。通过在线SNP分析平台(http://snpinfo.niehs.nih.gov/sn pinfo/snpfu nc.htm)，我们进一步发现这些位点分别位于相关基因的3'UTR，内含子，基因旁区和内含子区。鉴于3'UTR区是调节基因活性的关键区域，并和肿瘤的发生发展密切关联，因此本部分对mTOR-rs2536的生物学意义进行了功能学研究，探寻其可能的生物学调控机制。在本研究中，我们构建并克隆了含有mTOR3'UTR全序列的PGL3-Promoter-mTOR3，UTR质粒，质粒中分别导入mTOR-rs2536野生型及突变型碱基。双荧光素报告基因法检测结果显示，瞬时转染miRNA-767-3p类似物48小时后rs2536突变型的荧光相对比值要低于野生型，而该miRNA抑制剂的作用刚好相反，提示miRNA-767-3p对野生型碱基的抑制作用较明显，结果与前期相关性分析结果一致，提示该位点可能通过与相应miRNA结合进而影响mTOR的表达。在随后的SNPexp在线分析平台上做出的基因型-免疫表型相关性分析结果提示，mTOR-rs2536位点影响mTOR基因的表达水平，而且这种影响可能具有种族相关性。在本研究中，我们没有发现mTOR及其下游基因4EBP1和p70S6K的表达与mTOR-rs2536基因型之间的相关性;但我们发现，在癌组织中mTOR的表达水平(35.7％)要高于癌旁组织(28.8％);而4EBP1在癌组织及癌旁组织中的高表达率分别为32.1％和13.3％; p70S6K在癌组织及癌旁组织中的高表达率分别达到71.4％和39.4％。提示mTOR、4EBP1及p70S6K的活性与前列腺癌的发生或发展相关。
　　综上所述，mTOR-rs2536可能通过影响mTOR3'UTR与相应miRNA的结合达到调控mTOR的作用。但目前的实验证据还是比较轻微，只能作为一种参考，要证实mTOR3'UTR点突变对mTOR本身表达的实际影响，还需要找到本身带有mTOR该SNP的细胞系进行mRNA和蛋白质水平的研究，才具有确实的说服力。这是本论文的主要不足以及今后研究的方向。
　　第三部分 mTORC1相关基因遗传多态位点对前列腺癌临床结局的风险评估
　　在mTORC1相关基因的遗传变异因素与前列腺癌预后的相关性研究中，我们选取423例有较完善临床随访资料的前列腺腺泡腺癌患者，结合前期发病风险关联的易感位点mTOR-rs2536、-rs1034528和-rs2295080以及RPTOR-rs1062935不同基因型进行前列腺癌根治术后的生存预后风险评估。结果发现，在0.1的检验标准下，相对于mTOR-rs1062935TT基因型，携带CT/CC基因型的患者远期生化复发的几率要高（Plog-rank=0.067）;而在该标准下相对于mTOR-rs2536AA基因型，携带GG/AG基因型的患者近期生化复发的几率要高(PWilcoxon=0.056)。在56例前列腺癌蛋白质表达和预后相关性分析中我们发现，p70s6k的高表达能明显增加前列腺癌术后生化复发的几率，但是本研究中蛋白质表达与随访结果的例数非常有限，结果尚需加大样本量进一步验证。

目录

主要缩略词表

摘要

前言

第一部分 mTORC1相关基因遗传多态性与前列腺癌易感性的关联研究

研究背景

材料与方法

结果

讨论

第二部分 mTOR基因3’非翻译区阳性关联位点的功能学研究

研究背景

材料与方法

结果

讨论

第三部分 mTORC1相关基因遗传多态位点对前列腺癌临床结局的风险评估

研究背景

材料与方法

结果

讨论

总结

参考文献

综述 前列腺癌易感基因及遗传流行病学研究进展

论文发表情况

部分发表论文

致谢

声明