TNF-α介导炎症/凋亡相关基因功能性多态位点与宫颈癌易感性及预后关系的分子流行病学研究

摘要

宫颈癌是威胁女性健康的最常见的恶性肿瘤之一，在发展中国家，是发病率最高的女性生殖道恶性肿瘤。我国每年新增病例10万名，占全球病例的1/5，且近年来发病年龄呈逐渐年轻化的趋势。流行病学研究已证实高危型人乳头瘤病毒(HPV)在人体的持续感染是宫颈癌的主要病因和必要条件，而只有少部分HPV感染者发展为宫颈癌患者，提示个体对于宫颈癌具有遗传易感性。
　　肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是体内具有多种生物活性的细胞因子，能激活凋亡激酶(caspases，CASP)家族级联式反应，促进凋亡的发生。但在某些细胞中，它还能激活核转录因子-κB信号通路，招募促炎细胞因子白介素6(IL6)，促进炎症反应和抑制凋亡。此外，TNF-α的刺激还能促进TNF-α诱导蛋白8(TNFAIP8)的表达，抑制caspases的活化，抑制细胞凋亡。HPV E6能靶向作用于TNF-α受体，一方面抑制caspases活化，保护细胞逃避凋亡;另一方面，E6和E7协同参与调解TNF-α介导的核转录因子-κB细胞增殖途径，诱导细胞增殖和永生化。因此，HPV也参与了对细胞增殖/凋亡的调控，而这种调控的差异在很大程度是由遗传决定的，有可能是TNF-α介导炎症/凋亡通路中某些基因的多个功能性单核苷酸多态性(SNP)综合作用下导致个体的易感性所引起的。
　　本研究首次探索性地对TNF-α介导炎症/凋亡通路相关基因多态性与宫颈癌发病风险、临床治疗、预后结局的关系进行解析。我们的研究假设是:(1) TNF-α介导炎症/凋亡相关基因的潜在功能性SNPs单独或联合作用与宫颈癌易感性相关，且可能存在基因-基因和基因-环境交互作用;(2) TNF-α介导炎症/凋亡相关基因的功能性SNPs通过特定的生物学调控机制发挥作用;(3) TNF-α介导炎症/凋亡相关基因的潜在功能性SNPs与宫颈癌治疗效果及临床结局相关。
　　第一部分 TNF-α介导炎症/凋亡相关基因遗传多态位点与宫颈癌易感性的关联研究
　　为了研究TNF-α介导炎症/凋亡相关基因的潜在功能性SNPs与宫颈癌发病风险的相关性，我们在华东地区汉族人群中，选择1584例宫颈癌病例和1756例年龄、居住地频数相匹配的健康女性，开展病例-对照关联研究，SNPs的基因分型检测采用Taqman探针方法。在单个位点关联研究中，我们发现携带TNFAIP8-rs11064 GG基因型的妇女比AA/AG基因型携带者罹患宫颈癌的风险更高（校正OR2.16，95％ CI1.16-4.03）;相对于IL6-rs2069837 AA基因型，携带AG/GG基因型的妇女宫颈癌易感性更高（校正OR1.27，95％ CI1.08-1.49）。尽管CASP7-rs10787498突变纯合子GG基因型由于人数较少而显示无统计学意义，但是我们发现携带杂合子GT基因型的妇女比TT基因型者罹患宫颈癌的风险显著增加（校正OR1.19，95％ CI1.00-1.41）。此外，CASP7-rs4353229的TT基因型携带者较CC/CT携带者具有更大的宫颈癌罹患风险(OR1.20，95％ CI1.02-1.40)。
　　多个位点的联合分析结果显示，相对于携带0-1个危险基因型的妇女，当女性携带2-4个阳性单位点的危险基因型时，具有更高的宫颈癌罹患风险。我们分别对TNFAIP8、IL6、CASP7基因上的多个SNP位点进行联合分析，发现联合效应产生的相对危险度均明显高于单位点效应。同时，IL6基因的两个SNP位点所构成的Grs2069837Crs2069840单倍型相较于Ars2069837Crs2069840单倍型有更高的宫颈癌发生危险。此外，我们采用传统Logistic回归参数统计方法，发现CASP7基因SNPs之间、CASP7与IL6基因SNPs之间、环境因素与SNPs之间均存在两因素的相乘交互作用;多因子降维(MDR)非参数模型分析进一步显示，TNF-α介导炎症/凋亡通路相关基因的多个SNPs位点间存在高阶交互作用，共同参与了宫颈癌的发生过程。
　　综上所述，尽管缺少个体HPV感染的数据，本研究证实TNF-α介导炎症/凋亡通路相关基因SNPs与中国华东地区汉族女性的宫颈癌易感性相关，并初步揭示该通路相关基因-基因、基因-环境存在交互作用，在宫颈癌发生中的起了重要作用。当然，本研究的发现值得在其他中国人群或其他种族人群中加以验证，以进一步检验我们结论的可靠性和科学性。
　　第二部分 TNF-α介导炎症/凋亡相关基因阳性关联位点的功能学研究
　　本研究在关联研究的基础上，对有阳性关联的SNPs进行了功能学实验，探寻其特定的生物学调控机制。首先，我们根据HapMap基因分型与GENEVAR基因表达的数据平台，分析四个阳性关联SNPs的不同基因型携带者在基因mRNA表达水平之间的差异，结果发现TNFAIP8-rs11064位点无论在HapMap总体人群、还是中国汉族人群中都与TNFAIP8 mRNA表达水平相关（线性回归P=0.028和0.018）。组织芯片蛋白表达实验亦证实，携带突变G等位基因的宫颈癌患者较A等位基因携带者，其TNFAIP8蛋白表达显著增加(校正OR3.57，95％ CI1.09-11.72)。在进一步的功能学实验中，我们设计了构建携带TNFAIP8-rs11064不同等位基因的双荧光报告基因表达载体，与miR-22共转染细胞，结果发现相对于psiCHECK∶rs11064A转染组，psiCHECK∶rs11064G转染组的相对荧光素酶表达活性显著增加（HeLa，SiHa，A549和SW480细胞中Student'st检验P值分别为:P＜0.001，P＜0.001，P=0.009和P＜0.001），提示TNFAIP8-rs11064 A→G的改变能降低miR-22结合到TNFAIP83'-UTR的亲和力，导致TNFAIP8 mRNA表达水平的升高，激活TNF-α介导炎症/凋亡通路，使个体发生宫颈癌的风险增加。
　　综上所述，本研究发现TNFAIP8-rs11064位点上单核苷酸的变化会引起miR-22对TNFAIP8基因转录调控能力的改变，从而与宫颈癌易感性显著关联。
　　第三部分:TNF-α介导炎症/凋亡相关基因遗传多态位点对宫颈癌临床结局的风险评估
　　本研究在第一部分关联研究的基础上，选择148例宫颈鳞癌患者，进行体外MTT实验，以测定四种铂类化疗药物（顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂）对宫颈癌细胞的抑制率，并随访患者的生存结局，分析TNF-α介导炎症/凋亡相关基因潜在功能性SNPs与四种铂类化疗药物敏感性、患者生存的关系。结果显示，尽管SNPs与四种铂类化疗药物的癌细胞抑制率无显著相关性，但TNFAIP8蛋白低表达的细胞比高表达细胞对顺铂和奈达铂更加敏感（Wilcoxon检验，P=0.043和0.009），提示TNFAIP8高表达可能与宫颈癌铂类化疗药物抵抗相关。
　　宫颈癌预后分析发现，当宫颈癌患者为高FIGO分期(ⅡB期;校正HR5.53，95％ CI1.08-28.39)或肿瘤≥4 cm（校正HR3.65，95％ CI1.13-11.80）或脉管浸润阳性（校正HR3.14，95％ CI1.10-8.94）或携带TNFAIP8L1-rs1060555 GG基因型（校正HR3.25，95％ CI1.06-9.95）或高表达TNFAIP8蛋白(校正HR4.10，95％ CI1.38-12.15)时，其肿瘤复发的危险度显著增加;当脉管浸润阳性(校正HR8.72，95％ CI1.72-44.29)或TNFAIP8蛋白高表达(校正HR4.48，95％ CI1.02-19.64)时，患者的死亡危险度显著增加。
　　本研究首次证实TNF-α介导炎症/凋亡相关基因，尤其TNFAIP8家族基因的相关变异可能影响宫颈癌的发展、预后结局。我们将在本研究的基础上扩大和增加候选基因与位点，以期更加全面地了解TNF-α介导炎症/凋亡通路基因遗传变异在宫颈癌中的地位，为宫颈癌早期预防、个体化治疗、预后评估提供分子流行病学与遗传学证据。

目录

主要缩略词表

摘要

前言

第一部分 TNF-α介导炎症／凋亡相关基因遗传多态位点与宫颈癌易感性的关联研究

研究背景

材料和方法

结果

讨论

第二部分 TNF-α介导炎症／凋亡相关基因阳性关联位点的功能学研究

研究背景

材料和方法

结果

讨论

第三部分 TNF-α介导炎症／凋亡相关基因遗传多态位点对宫颈癌临床结局的风险评估

研究背景

材料和方法

结果

讨论

总结

参考文献

综述 宫颈癌基因多态性研究的现况与展望

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