sgf73+在裂殖酵母中的全基因组遗传筛选

摘要

遗传相互作用通常存在于功能关联的基因之间，而这一关联最终反映在细胞乃至有机体的表型变化。两个基因间如果具有遗传相互作用，其对应的双突变体表型会与预期表型存在差异，遗传相互作用越强，表型差异越显著。遗传筛选是研究基因遗传相互作用的重要方法，对阐明生物过程具体机制，发现基因新功能具有提示作用。
　　SAGA复合物是真核生物中高度保守的多功能染色质重塑复合体，由21个亚基组成组蛋白乙酰化、组蛋白去泛素化等5个功能模块，在转录激活、组蛋白修饰、mRNA转运等生物过程中发挥作用。早期的研究多集中在SAGA复合物整体功能和各个模块功能的探究，而较少关注其各亚基的单独生物学功能。Sgf73是SAGA复合物去泛素化模块亚基，在真核生物中高度保守。由于Sgf73发现较晚，它在裂殖酵母生物过程中发挥的作用尚未阐明。本论文希望通过遗传筛选的方法，寻找到与sgf73+具有遗传相互作用的裂殖酵母非必需基因，并通过深入挖掘遗传关系，对sgf73+的作用机制和潜在新功能进行探究。
　　在本研究中以sgf73+为查询基因，利用合成基因阵列的筛选方法，与裂殖酵母非必需基因突变体文库中的3256个突变体进行遗传相互作用分析，最终筛选到了206个与sgf73+具有遗传相互作用的基因，其中negative遗传相互作用基因164个，positive遗传相互作用基因42个。在这206个基因中，有74个基因的遗传相互作用是本研究新发现的。对筛选结果进行GO分析发现，与sgf73+具有遗传相互作用的基因富集在染色质修饰、DNA损伤修复、压力应答、转录、细胞周期、信号转导、物质运输、生物代谢等过程，提示sgf73+可能在上述生物过程中发挥作用。
　　组蛋白共价修饰是一种可逆的翻译后修饰作用，与转录调控、DNA损伤修复密切相关。遗传筛选表明sgf73+与26个染色质修饰基因具有遗传相互作用，进一步的组蛋白修饰检测表明，sgf73+的缺失能够引起H3K9、H4K16位点处的乙酰化水平下降，在H3K9位点处乙酰化下调水平约为20％，在H4K16位点处乙酰化下调水平达到30％。sgf73+的缺失还能引起组蛋白H3K4甲基化上升。相对于ash2⊿中极低的H3K4甲基化水平，sgf73⊿ash2⊿菌株中的甲基化水平基本恢复至野生型的水平。这是第一次在裂殖酵母中证实sgf73+的缺失可以引起组蛋白H3K9、H4K16乙酰化下降，H3K4甲基化上升。
　　遗传筛选结果显示sgf73+与DNA损伤修复、压力应答相关基因具有遗传相互作用。系列稀释实验发现sgf73△对DNA损伤试剂HU、CPT，以及H2O2具有一定程度的敏感性，并且在遗传上与DNA同源重组修复基因rad51+位于一条通路，提示sgf73+能够在DNA损伤修复过程中发挥作用。
　　对sgf73+和筛选到的维持微管动态稳定性的基因klp6、tipl+、mal3+进行微管解聚药物TBZ敏感性检测，发现sgf73+能以不依赖于SAGA复合物酶学活性的方式参与对TBZ的应答，并与klp6+处于相同遗传通路。荧光显微观察微管形态发现，sgf73+缺失能够引起微管变短，通过在sgf73Δ中过量表达Klp6蛋白可以回补这一变化。该结果提示sgf73+与klp6+位于相同通路且处在klp6+上游，共同调控微管动态平衡。
　　综上所述，本研究通过遗传筛选的方法获得了206个与SAGA复合物亚基Sgf73具有遗传相互作用的非必需基因，并通过进一步的实验证实sgf73+在组蛋白乙酰化、甲基化修饰、DNA损伤修复以及微管动态稳定性调节过程中发挥作用。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料与方法

一．材料

二．实验方法

结果

1．sgf73+遗传相互作用基因的大规模筛选

2．对206个遗传相互作用基因GO分析

3．sgf73+的缺失影响组蛋白乙酰化和甲基化修饰

4．sgf73+参与DNA损伤试剂和高氧应答

5．sgf73+参与调节微管动态稳定性

讨论

全文总结

参考文献

综述：遗传相互作用在探索生物功能中的研究进展

硕士期间发表论文

硕士期间所获荣誉及科研资助

致谢