AraC家族转录调节蛋白Rsp对金黄色葡萄球菌毒力的调节及机制

摘要

革兰阳性菌特别是金黄色葡萄球菌是目前医院感染最常见的病原体之一，可引起多种人类疾病，包括化脓性炎症，如伤口化脓、骨、关节的感染，也可引起内脏器官的感染，如肺炎、脓胸、中耳炎、心包炎、心内膜炎等;另外严重者可引起全身感染如败血症、脓毒血症等[1]。随着β-内酰胺类抗生素的广泛应用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)随之增加，且引起的感染和病死率有逐年增加的趋势[2]。特别是1999-2000年，高致病力社区来源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌出现，主要引起严重的败血症以及致死性肺炎等，感染者死亡率明显增高[3]。由于其高致病力和高致死率，国际上将其作为继HIV之后第二大危及人类生命的病原微生物，其毒力因子及致病机理是目前国际各研究部门研究热点。
　　金黄色葡萄球菌毒力因子的表达受一系列调控系统的调控，其中最重要的一个系统是agr系统（附属基因调节子），它调控大多数胞外蛋白的表达，并且可以通过细胞浓度依赖性机制调节多种毒力基因的表达来调节细菌的致病性[4]。同时，金黄色葡萄球菌的毒力也受sarA，sae，sarS和rot等基因的调节[5]。金黄色葡萄球菌的毒力是多因素调控的，这些调控因素之间的相互关系以及整个调控网络还需要进一步研究。金黄色葡萄球菌外分泌型毒素—溶血素是其最重要的毒素之一。目前对金黄色葡萄球菌溶血素表达调控的具体机制尚存在诸多的不清楚。因此从全基因组水平全面了解对金黄色葡萄球菌溶血素表达有明显调节作用的基因，明确其对细菌毒力具体的调节作用以及机制，补充和完善金黄色葡萄球菌毒力因子的调控网络，为高致病力金黄色葡萄球菌如何引起疾病的毒力调节通路提供新的实验依据。
　　第一部分 转座子插入突变文库的建立及筛选
　　目的:构建转座子随机插入突变库，并筛选出对溶血功能有明显调节作用的基因。方法:使用本实验室构建并已申请国家专利的真核转座酶为基础的转座系统构建BD02-25转座子随机插入突变文库，通过用5％羊血平板筛选出与野生株相比溶血明显改变的克隆，接着运用随机引物反向PCR和测序等方法鉴定出突变基因。结果:在BD02-25中建立了一个库容量约为104个克隆的转座子随机插入突变文库，筛选并确定溶血能力较野生株明显改变的插入突变株。运用随机引物反向PCR和测序等方法鉴定出突变基因，运用生物信息学方法分析这些基因的可能功能。其中25株α毒素表达明显下降的突变菌株中，有4株克隆转座子分别插入到AraC/XylS家族转录调节基因(SAUSA3002326)的4个不同位置均导致溶血功能明显下降。经鉴定，此转录调节基因编码的蛋白（701个氨基酸）与金黄色葡萄球菌中生物膜调节基因rsp编码的蛋白有99％的同源性，因此可判定为同一基因。结论:AraC/XylS家族转录调节基因rsp可调节金黄色葡萄球菌的溶血功能。
　　第二部分 AraC/XylS家族转录调节蛋白Rsp的功能研究
　　目的:研究AraC/XylS家族转录调节蛋白Rsp在金黄色葡萄球菌的功能。方法:使用PKOR1质粒通过同源重组方法构建金黄色葡萄球菌BD02-25 rsp基因突变株，用PRB473质粒获得rsp基因互补表达株，并绘制野生株、突变株、互补表达株生长曲线。通过半定量生物膜实验分析rsp基因敲除前后对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响。接着通过小鼠菌血症与皮肤脓肿模型实验对其编码蛋白的功能进行研究。之后使用RNA-sequence方法观察指数生长后期相同CFU的野生株与突变株表达谱的差异，并用定量RT-PCR方法验证RNA-sequence的结果。结果:生长曲线表明rsp基因突变株的生长稍慢于野生株与互补表达株，但24小时后生长无明显差异。半定量生物膜实验表明rsp可下调生物膜的形成。小鼠菌血症模型实验中，rsp基因突变株的生存百分率明显高于野生株，小鼠皮肤脓肿模型实验中，野生株的脓肿面积明显大于rsp基因突变株。RNA-sequence结果提示，rsp可以上调多种基因（溶血毒素hla，hld，hlg，蛋白酶sspA，sspB和sspC以及调节基因agrD，sarR等）的表达，也可下调多种基因(sasG，ure，icaA以及蛋白酶基因atl等)的表达。定量RT-PCR验证了RNA-sequence的结果，即rsp对细菌毒力因子(hla，RNAⅢ及PSM)的表达有上调作用，而对细菌生物膜形成相关基因（icaA）及代谢相关因子的表达有下调作用。结论:AraC/Xyls家族转录调节蛋白Rsp可上调金黄色葡萄球菌毒力的表达。
　　第三部分 Rsp蛋白调控金黄色葡萄球菌毒力的机制研究
　　目的:研究AraC/XylS家族转录调节蛋白Rsp对金黄色葡萄球菌毒力的调节机制。方法:诱导表达并纯化含DNA结合域的Rsp蛋白，通过凝胶迁移率实验(EMSA)观察Rsp蛋白与目的基因启动子的结合作用。结果:凝胶迁移率实验显示agrD基因启动子与Rsp蛋白的DNA结合结构域有结合作用，表明Rsp蛋白通过与靶基因的结合来发挥调控作用。结论:AraC/Xyls家族转录调节蛋白Rsp通过结合重要的调节基因如agrD的启动子来调节金黄色葡萄球菌的毒力，从而影响其致病力。

目录

英文缩略词表

摘要

前言

第一部分 转座子插入突变文库的建立及筛选

引言

材料和方法

结果

讨论

第二部分 AraC／XylS家族转录调节蛋白Rsp的功能研究

引言

材料和方法

结果

讨论

第三部分 Rsp蛋白调控金黄色葡萄球菌毒力的机制研究

引言

材料和方法

结果

讨论

总结

参考文献

综述 金黄色葡萄球菌的毒力与传播

致谢

附录

声明