长链非编码RNa-PCA3在前列腺癌中的功能及分子机制的初步研究

摘要

第一部分、pGLV3/H1-shRNA干扰稳转株及pCDH-GFP-PCA3过表达稳转株的筛选与验证
　　目的:PCA3基因在前列腺癌中高度特异性的表达，预示着PCA3对前列腺癌的发生发展起着重要作用。目前，PCA3在前列腺癌中的功能及机制尚不清楚。为了探究其功能，我们通过构建PCA3的干扰及过表达载体，并筛选出相应的稳转株，为后续的体外功能研究提供依据。
　　方法:从Genbank中查找PCA3基因的序列号及其对应序列，使用Premier5.0软件设计针对PCA3分子的shRNA，分别构建4对pGLV3/H1-sh2456，pGLV3/H1-sh2618，pGLV3/H1-sh2702及pGLV3/H1-sh2913干扰载体及pGLV3/H1-control对照，以下调其在LNCaP细胞中的表达。将构建好的干扰载体包装成病毒后感染LNCaP细胞，经realtime PCR验证后筛选出干扰效率较高的细胞株;从PCA3高表达的前列腺癌细胞系LNCaP中提取总RNA，然后反转录成cDNA。设计三对引物，以cDNA为模板扩增3个分片段，通过重叠延伸后连接成全长构成PCA3。将PCA3与pCDH-GFP质粒分别进行双酶切后进行连接，转化感受态细胞DH5α，挑选克隆后并经PCR、酶切进行验证，送测序。将构建好的pCDH-GFP-PCA3表达质粒包装成病毒后感染前列腺癌细胞株DU145及PC3，流式分选并经real time PCR验证后获得分别过表达PCA3及含空载的稳定细胞株。
　　结果:测序结果表明成功构建了干扰载体，而且real time PCR结果同时证实并建立了稳定低表达PCA3的前列腺癌细胞株及稳定高表达PCA3的前列腺癌细胞株。
　　结论:PCA3干扰及过表达载体的成功构建，为深入研究PCA3基因在前列腺细胞中的作用奠定了基础，进而为探索前列腺癌治疗的新途径提供了可能。
　　第二部分、研究PCA3干扰和过表达后对前列腺癌细胞功能的影响及机制的初步研究
　　目的:研究PCA3干扰和过表达后在体外对前列腺癌细胞的增殖、周期、迁移及侵袭的影响。
　　方法:将第一部分筛选出的稳转细胞株，通过CCK-8法(PCA3过表达实验)和EdU法（PCA3干扰实验）及细胞克隆形成实验测定细胞增殖能力，通过流式细胞仪测定细胞周期，transwell小室检测细胞的迁移及侵袭能力。并将存在功能差异的干扰细胞进行转录组测序，探求两组细胞在转录水平分子的表达差异。
　　结果:下调PCA3的表达后，LNCaP细胞株实验组较对照组的增殖能力下降(P＜0.05)，且迁移（P=0.0001）与侵袭（P＜0.0001）能力也显著下降，差异有统计学意义。而在DU145及PC3细胞中过表达PCA3后，细胞在增殖、迁移及侵袭的生物学功能方面与对照组相比无明显差异。转录组测序结果发现，下调PCA3分子后，实验组中与细胞粘附信号通路的基因表达有明显的下降，而参与TGF-beta信号通路的基因表达明显上升。
　　结论:PCA3可能在前列腺癌的发生发展中起重要作用，下调PCA3后能显著抑制前列腺癌细胞株LNCaP的生长及迁移侵袭能力，预示着PCA3可能是治疗前列腺癌的一个潜在靶点。转录组测序结果提示，PCA3分子可能通过影响细胞粘附分子的表达及TGS-beta的表达水平来影响细胞的增殖、迁移及侵袭。

目录

英文缩略词表

摘要

引言

第一部分 pGLV3／H1-shRNA干扰稳转株及PCDH-GFP-PCA3过表达稳转株的筛选与验证

前言

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、实验讨论

第一部分 小结

第二部分 研究PCA3过表达和干扰后对前列腺癌细胞功能的影响及机制的初步研究

前言

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

三、实验结果

四、实验讨论

第二部分 小结

参考文献

综述 长链非编码RNA在前列腺癌中的研究进展

硕士期间发表论文

致谢

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