胰腺癌及其播散途径中调节性T细胞分布和调控机理研究

摘要

胰腺腺癌是具有高度侵犯性及危害性的恶性肿瘤，起病隐匿且极易转移，缺乏有效的早期诊断方法，现有的手术及放化疗等抗肿瘤治疗疗效均欠理想，1年及5年生存率仅分别为23％及5％。研究胰腺癌的发生发展机制，可能发掘预测胰腺癌预后、复发和转移的新指标及抗肿瘤治疗的靶点，具有重大的临床价值及社会效益。
　　调节性T细胞(Regulatory T cell，T reg)，具有抑制抗肿瘤免疫，促进肿瘤逃逸免疫监视的作用。大量报道显示具有CD4+CD25+（相当于CD4+CD25+FOXP3+或CD4+CD25+CD127Low/-）免疫表型的调节性T细胞在包括胰腺癌在内的多种恶性肿瘤的肿瘤组织和外周血中的比例高于健康人。检测Treg在肿瘤组织和播散途径中的分布可能具有预测肿瘤预后、复发和转移的作用。抑制Treg生长及迁徙可能成为抗肿瘤治疗的新策略，Treg亦有可能成为评价抗肿瘤治疗效果的指标之一。
　　已知CD4+CD25+T reg的分布水平受某些细胞因子调控，其中细胞因子CCL22对CD4+CD25+T reg有趋化作用，因CD4+CD25+T reg所表达的CCR4是CCL22的受体。多种胰腺癌细胞株可分泌CCL22，但人胰腺癌组织中的CCL22表达情况至今尚不明确。
　　CCL22表达受多步骤调节，在转录水平上CCL22可接受NF-κB等转录因子的调节。课题小组前期研究及其他研究者均发现具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的原癌基因Pim-3在胰腺癌中高表达，而在非癌胰腺组织中不表达，提示Pim-3在胰腺癌的发生过程中发挥作用。Pim-3与Pim-1和Pim-2属于同一原癌基因家族，已知Pim-1能够上调NF-κB转录活性。因此本课题拟研究与Pim-1具有高度同源性(71％)的Pim-3是否可能同样通过激活NF-κB，促进胰腺癌中CCL22的表达，进一步明确Pim-3在胰腺癌发生发展过程中的作用，尤其是通过细胞因子信号途径调节肿瘤微环境中免疫细胞分布的可能性，为胰腺癌的复发、转移和预后判断及治疗靶点的发掘提供新的思路。
　　第一部分 调节T细胞在胰腺癌中的分布及肿瘤细胞Pim-3，CCL22的表达与胰腺癌预后的相关性研究。
　　目的：
　　探究原癌基因Pim-3及趋化因子CCL22的表达与调节性T细胞之间相互作用关系，并探讨三者作为胰腺导管腺癌预后，复发及转移判断指标的可行性。
　　方法：
　　流式细胞术检测胰腺导管腺癌(Pancreatic Ductal Adencarcinoma，PDAC)患者外周血、肿瘤引流通路上淋巴结(Tumor draining lymph nodes，TDLN)中Treg的计数，免疫组化检测肿瘤组织Pim-3及CCL22表达与肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)中Treg计数。统计分析61例PDAC患者临床病历资料，探讨Pim-3，CCL22表达，外周血，TDLN及TIL内Treg计数与胰腺导管腺癌预后间关系。
　　结果：
　　1、流式细胞术检测显示:PDAC患者TDLN内Treg计数高于其外周血，差异有统计学意义。
　　2、IHC检测显示:肿瘤组织Pim-3与CCL22表达显著高于邻近癌旁组织，肿瘤浸润淋巴细胞中FOXP3+Treg计数显著高于邻近癌旁组织。Pim-3表达与CCL22表达均与肿瘤浸润淋巴细胞中FOXP3+Treg计数呈正相关。
　　3、生存分析
　　1)61例PDAC中随访资料完整的患者共54人，失访7例。54例PDAC患者无病生存率为44.4％(24/54)，总生存率为53.7％(29/54);复发转移率为55.6％(30/24)，病死率为46.3％(25/54)。
　　2) Kaplan-Meier单因素生存分析显示:高表达Pim-3及CCL22组与高TDLNTreg组患者无进展生存期及总生存期明显缩短.Cox多因素生存分析显示TDLNTreg计数是影响无病生存时间及总生存时间的独立预后因子。
　　结论：
　　肿瘤组织Pim-3与CCL22表达均与TIL FOXP3+Treg计数呈正相关;肿瘤组织Pim-3表达增强，CCL22表达增强，TDLN Treg计数升高的患者无进展生存期与总生存期均缩短，而TDLN Treg计数是预测胰腺导管腺癌患者预后的独立风险因子。
　　第二部分 Pim-3与CCL22在胰腺癌中表达的相关性及调控关系研究。
　　目的：
　　分别在人胰腺癌细胞株PCI-55，其对应的稳定敲除Pim-3的细胞株PKD以及人胰腺导管腺癌组织中检测Pim-3与CCL22表达，并分析二者之间相关性;通过体外和体内实验初步探讨CCL22与Pim-3之间可能的相互作用关系。
　　方法：
　　1、准备高表达Pim-3的人胰腺导管腺癌细胞株PCI55.
　　2、构建该细胞株的Pim3敲除稳定转染细胞株PKD.
　　3、验证PKD细胞株Pim-3表达:分别用实时荧光定量反转录PCRreal-timeRT-PCR)与蛋白印迹实验(we stern blot)验证Pim-3表达。同时采用real-timeRT-PCR验证CCL22表达。
　　4、收集细胞培养上清液，采用酶联免疫吸附试验ELISA检测以上两种人胰腺癌细胞株中CCL22蛋白表达并定量。
　　5、免疫组化（immunohistochemistry，IHC）方法检测第一部分中收集的61例胰腺导管腺癌标本肿瘤组织Pim-3与CCL22表达并分析其相关性。
　　结果：
　　1、IHC结果显示:PDAC肿瘤组织中Pim-3与CCL22的表达呈正相关，差异有统计学意义。
　　2、real-time RT-PCR结果显示:人胰腺腺癌细胞株PCI-55的Pim-3与CCL22的mRNA水平均明显高于PKD细胞株，差异均有显著性，且二者之间呈正相关，差异有统计学意义。
　　3、Western blot结果显示:PCI-55细胞株Pim-3表达明显强于PKD。
　　4、ELISA结果显示:PKD细胞株培养上清液内CCL22滴度低于PCI-55细胞株，差异有统计学意义。
　　结论：
　　Pim-3与CCL22在人胰腺癌细胞系与导管腺癌组织中的表达具有相关性，且二者之间呈现正相关。

目录

摘要

引言

参考文献

第一部分 胰腺导管腺癌及其转移播散途径中调节T细胞分布及调控及其与细胞因子CCL22及原癌基因Pim-3表达的相关性

材料及方法

结果

讨论

参考文献

小结

第二部分 原癌基因Pim-3与细胞因子CCL22在胰腺癌中表达的相关性及调控关系研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

小结

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文献综述 CD4+CD25+调节T细胞与胰腺导管腺癌免疫研究进展

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