金黄色葡萄球菌和屎肠球菌对新型噁唑烷酮类抗菌药MRX-I产生耐药的可能性及耐药机制研究

摘要

本研究通过对金黄色葡萄球菌及肠球菌对MRX-Ⅰ的诱导耐药产生情况和耐药机制、自发耐药频率和耐药机制、MRX-Ⅰ对携带cfr革兰阳性菌的体外抗菌活性、防突变浓度及耐药突变选择窗四方面的研究，以了解细菌对MRX-Ⅰ出现耐药性的可能性及耐药机制，进而降低/避免新药开发风险，为MRX-Ⅰ在后期临床试验的开展及将来临床应用过程中减缓耐药提供参考。
　　第一部分 金黄色葡萄球菌和屎肠球菌对MRX-Ⅰ的诱导耐药及耐药机制
　　背景:噁唑烷酮类抗菌药诱导金黄色葡萄球菌和肠球菌产生耐药的速度慢，耐药机制主要为23S rRNA的Ⅴ区基因突变、核糖体蛋白基因突变。噁唑烷酮类不同品种结构不同，诱导细菌产生耐药的情况和耐药机制呈现多样性。本部分研究通过MRX-Ⅰ持续诱导，了解MRX-Ⅰ诱导金黄色葡萄球菌和屎肠球菌耐药发生的情况及耐药机制。
　　方法与结果:采用肉汤稀释法，对受试菌以1/2×MIC的MRX-Ⅰ持续诱导。测定MRX-Ⅰ诱导受试菌发生耐药的情况。对每个MIC值上升1倍或1倍以上的菌株进行MIC稳定性、对其它抗菌药的敏感性测定，并对稳定的耐药突变株用PCR进行扩增23S rRNA的Ⅴ区域6个基因拷贝和核糖体蛋白L3、L4和L22编码基因rplC、rplD和rplⅤ并测序比对。耐药突变株在本文是指MIC值上升菌株，MIC值可以达到或未达到CLSI的耐药折点。受试菌4株金黄色葡萄球菌包括甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)菌株ATCC29213、MRSA菌株ATCC33591、临床分离MRSA菌株SA0016和SA0017。3株屎肠球菌包括万古霉素敏感屎肠球菌(VSE)菌株ATCC35667、临床分离VRE菌株BM4147和Efm-HS0661。平行对照药为利奈唑胺。
　　经过30代持续诱导，MRX-Ⅰ对MSSA和MRSA的MIC均仅升高8或16倍。而利奈唑胺MIC对MSSA升高128倍、对MRSA升高16-32倍，且开始产生耐药代数较早。MRX-Ⅰ诱导耐药株的23S rRNA基因主要突变位点6个:U2504A、C2443U/A2513G/U2571C/U2622C/A2629U（新组合突变，其中C2443U、A2513G、U2622C和A2629U为新突变）;核糖体L3蛋白突变位点5个，包括G152D、G155R、G155R/M169I(M169I为新突变)、F147L/G155R和F147L/G155R/D159Y（新组合突变）。利奈唑胺诱导耐药株的23S rRNA基因主要突变位点共7个:U2504A、另外是一个组合突变为C2443U/U2474C/A2513G/U2571C/U2622C/A2629U（新组合突变，U2474C新突变）。MRX-Ⅰ和利奈唑胺诱导金黄色葡萄球菌耐药株均未发生核糖体蛋白L4和L22位点突变。
　　经过35代（VSE为16代）持续诱导，MRX-Ⅰ和利奈唑胺对VSE的MIC升高了4倍，对VRE的MIC升高了32和8-16倍。除Efm-HS0661(VRE)在利奈唑胺MIC升高至8和16mg/L时出现了23S rRNA基因1％和2％的U2500A突变外，其它均未发现23S rRNA基因的突变。MRX-Ⅰ诱导VSE耐药株产生了L4核糖体蛋白F24I的新突变，诱导VRE产生了L22核糖体蛋白D36N/D70N的新组合突变，核糖体蛋白L3未发生突变。利奈唑胺诱导VSE和VRE耐药株均产生了L4核糖体蛋白的A73V突变，核糖体蛋白L3和L22未发生任何诱导突变。金黄色葡萄球菌和屎肠球菌基因突变与耐药性的相关性尚需进一步研究确认。
　　小结:金黄色葡萄球菌对MRX-Ⅰ产生耐药的可能性很低，且比利奈唑胺体外更不易产生耐药。诱导耐药突变主要发生于23S rRNA和L3核糖体蛋白基因，屎肠球菌对MRX-Ⅰ产生耐药的可能性也很低，诱导耐药突变以核糖体蛋白突变为主。
　　第二部分 金黄色葡萄球菌和屎肠球菌对MRX-Ⅰ自发耐药频率和耐药机制
　　背景:自发耐药频率是细菌对抗菌药固有耐药性的重要特征。本部分研究金黄色葡萄球菌和屎肠球菌对MRX-Ⅰ的体外自发耐药频率，并分析耐药突变株对MRX-Ⅰ自发突变耐药机制。
　　方法与结果:采用琼脂稀释法测定7株受试菌（同第一部分，包括4株金黄色葡萄球菌和3株屎肠球菌）在4×MIC的MRX-Ⅰ作用下的自发耐药频率。PCR扩增和测序比对自发突变耐药株23S rRNA的Ⅴ区和核糖体蛋白L3、L4、L22基因与亲代的差异，找出基因突变位点。受试药还包括利奈唑胺、万古霉素、夫西地酸、克林霉素和利福平。
　　MRX-Ⅰ对金黄色葡萄球菌ATCC标准株ATCC29213(MSSA)、ATCC33591(MRSA)，以及2株临床分离株SA0016和SA0017的自发耐药频率分别为:＜8.25×10-12、＜6.33×10-12、＜2.96×10-13和＜4.52×10-13，与利奈唑胺的自发耐药频率相仿，比其它受试药低约1万倍。ATCC33591对MRX-Ⅰ自发耐药突变株发生23S rRNA插入突变ins2468C，利奈唑胺突变株出现了G2405U的突变;对MRX-Ⅰ和利奈唑胺的自发突变耐药突变株均未发生核糖体蛋白L3、L4、L22突变。
　　MRX-Ⅰ对3株屎肠球菌包括1株ATCC标准株ATCC35667(VSE)和2株VRE临床分离株（BM4147和Efm-HS0661）的自发耐药频率分别为:＜1.54×10-11、＜1.43×10-11和＜1.18×10-11，与利奈唑胺的自发耐药频率相仿，比其它受试药至少低10倍。ATCC35667突变株核糖体蛋白、23S rRNA的1和2号等位基因无突变，3-6号等位基因未扩增成功。金黄色葡萄球菌和屎肠球菌基因突变与耐药性的相关性尚需进一步研究确认。
　　小结:金黄色葡萄球菌(MSSA和MRSA)和屎肠球菌(VSE和VRE)对MRX-Ⅰ的自发耐药频率极低。23S rRNA突变可能是自发耐药突变株的主要耐药机制。
　　第三部分 MRX-Ⅰ对携带cfr革兰阳性菌的体外抗菌活性
　　背景:本部分研究旨在了解MRX-Ⅰ对携带cfr兰阳性菌的体外抗菌活性。
　　方法与结果:采用微量稀释法测定MRX-Ⅰ对3株动物源携带cfr革兰阳性菌的最低抑菌浓度(MIC)。受试菌分别为粪肠球菌EF-01、芽孢杆菌3-151和科氏葡萄球菌2-141。同时测定MIC的药物有:利福平、诺氟沙星、万古霉索、甲氧西林、克林霉素、红霉素、氯霉素、泰妙菌素和氟苯尼考。
　　MRX-Ⅰ对粪肠球菌EF-01的MIC值为2 mg/L，利奈唑胺为4 mg/L（根据CLSI判定标准，仍为敏感，但MIC明显上升）。该菌除对万古霉素(2 mg/L)和利福平(1 mg/L)敏感外，对其它抗菌药均为耐药。
　　MRX-Ⅰ对芽孢杆菌3-151的MIC值(2 mg/L)和利奈唑胺(4 mg/L)接近。该菌对氯霉素为中介(16 mg/L)，克林霉素耐药(＞64 mg/L)，对万古霉素、甲氧西林及红霉素(均为0.5 mg/L)、利福平(≤0.031 mg/L)、诺氟沙星(4 mg/L)均敏感。
　　MRX-Ⅰ对科氏葡萄球菌2-141的MIC值＞64 mg/L，利奈唑胺及其它8个抗菌药物的MIC值也＞64 mg/L。诺氟沙星对该菌具有抗菌活性(2 mg/L)。
　　小结:MRX-Ⅰ对携带cfr基因革兰阳性菌的MIC值与利奈唑胺一致，表现为耐药或MIC值明显上升，说明MRX-Ⅰ与利奈唑胺存在交叉耐药。
　　第四部分 MRX-Ⅰ对金黄色葡萄球菌和屎肠球菌防突变浓度和突变选择窗
　　背景:本部分对MRX-Ⅰ金葡黄色葡萄球菌及屎肠球菌的MPC和MSW进行研究，了解MRX-Ⅰ的MPC和MSW。
　　方法与结果:采用琼脂平板稀释法，富集约1010 CFU/mL受试菌，分别测定MRX-Ⅰ及其它受试药的防突变浓度MPC（无菌落生长的药物浓度），获得MIC与MPC之间的浓度范围，即耐药MSW（突变选择窗）。7株受试菌包括4株金黄色葡萄球菌及3株屎肠球菌（同第一部分）。受试药还包括利奈唑胺、万古霉素、夫西地酸和克林霉素。
　　MRX-Ⅰ对MSSA的MPC和MSW分别为4和2-4 mg/L，对MRSA的MPC为2或4mg/L、MSW为1-2或1-4 mg/L。提示MRX-Ⅰ对MSSA和MRSA的MSW范围相仿，且MSW均很窄。万古霉素对MSSA和MRSA的MPC为32 mg/L，MSW为1-32mg/L。夫西地酸对MSSA和MRSA的MPC为＞2或＞4 mg/L，MSW为0.125-＞4或0.063-＞2 mg/L。克林霉素对MSSA的MPC为8 mg/L，MSW为0.125-8 mg/L。
　　MRX-Ⅰ对3株屎肠球菌的MPC分别为4、2和4mg/L，耐药突变选择窗分别为2-4、1-2和1-4 mg/L。MRX-Ⅰ对VSE和VRE的MSW数值相仿，且MSW均很窄。万古霉素对VSE的耐药突变选择窗为0.5-8 mg/L。克林霉素对VSE的MSW为0.063-1mg/L，对BM4147(VRE)的耐药突变选择窗为2-64 mg/L。
　　MRX-Ⅰ与利奈唑胺对7株受试菌MSW结果相仿，比万古霉素和其它抗菌药的MSW窄8倍或8倍以上。
　　小结:MRX-Ⅰ对4株金黄色葡萄球菌和3株屎肠球菌的MSW均为MIC至2倍或4倍MIC，较万古霉素、夫西地酸、克林霉素的MSW窄8倍或8倍以上。提示MRX-Ⅰ对耐药亚群的选择性富集压力低。

目录

本文缩略词

摘要

第一部分 金黄色葡萄球菌和屎肠球菌对MRX-Ⅰ的诱导耐药及耐药机制

前言

第一节 MRX-Ⅰ对金黄色葡萄球菌和屎肠球菌的诱导耐药

材料与方法

结果

第二节 MRX-Ⅰ诱导金黄色葡萄球菌和屎肠球菌耐药株的耐药机制

材料与方法

结果

小结

参考文献

第二部分 金黄色葡萄球菌和屎肠球菌对MRX-Ⅰ自发耐药频率和耐药机制

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分 MRX-Ⅰ对携带cfr革兰阳性菌的体外抗菌活性

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第四部分 MRX-Ⅰ对金黄色葡萄球菌和屎肠球菌的防突变浓度和突变选择窗

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

全文总结

创新点和展望

文献综述 细菌对噁唑烷酮类抗菌药的耐药性和耐药机制

在读期间发表的文章

在读期间参加的重要学术会议

在读期间申请基金及参与的课题

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