茶溴香酰胺脂质体的制备和抗肺癌活性的研究

摘要

目的：茶氨酸具有降压、镇静、提高机体免疫力、对某些抗癌药物的生物调节作用、提高化疗效果，降低化疗副作用等多种药理作用，与传统化学药物相比具有毒性低的特点。脂质体是一种靶向药物载体，具有减少药物的剂量和降低药物的毒性的特点，本实验室合成的茶氨酸衍生物茶溴香酰胺（TBrC），经过前期研究显示了较高的抗癌活性，为更好地发挥其抗癌作用，增加药物在体内外药效，提高生物利用度，本课题制备了茶溴香酰胺脂质体（TBrC-L）和其与紫杉醇的复方脂质体（TBrC+P-L），考察其制备方法、处方和工艺及稳定性，以紫杉醇脂质体等为阳性对照，通过体外实验，研究了制备的脂质体对人肺癌细胞生长和迁移的影响与其作用的分子机制。
　　方法：
　　1.建立TBrC-L和TBrC+P-L的HPLC含量测定方法；以包封率为指标，通过单因素实验筛选TBrC-L和TBrC+P-L的制备方法并进行工艺优化，确定最佳处方；对TBrC-L和TBrC+P-L进行初步稳定性和质量研究。
　　2.使用MTT法和流式细胞术分别检测TBrC-L和TBrC+P-L对人肺癌A549细胞生长和凋亡的影响。
　　3.用Transwell chamber法观察TBrC-L和TBrC+P-L对人肺癌A549细胞迁移的影响。
　　4.应用蛋白印迹技术检测TBrC-L和TBrC+P-L对人肺癌A549细胞中与生长和迁移相关的蛋白的表达进行检测，并探索其可能作用的分子机制。
　　结果：
　　1.采用薄膜-超声分散法分别得到了TBrC-L和TBrC+P-L，通过单因素试验筛选TBrC-L的最优处方是：磷脂与胆固醇的比为10:1，脂药比为5:1，氯仿为10mL，生理盐水为15mL；TBrC+P-L的最优处方是：磷脂与胆固醇的比为10:1，茶溴香酰胺与紫杉醇的质量比为4:1，氯仿为10mL，生理盐水为15mL。该工艺条件下，TBrC-L的平均包封率可达76.6％，TBrC+P-L中TBrC的包封率为64.5%，紫杉醇的包封率为42%，且粒径分布均匀，批间差异较小。
　　2.MTT结果表明：16～250μM的TBrC-L和TBrC+P-L对人肺癌A549细胞的生长均表现出抑制作用，并呈现出显著的剂量—时间依赖关系。流式细胞术分析显示TBrC-L和TBrC+P-L可以促进人肺癌A549细胞发生凋亡。
　　3.Transwell chamber检测结果表明：TBrC-L和TBrC+P-L可以降低人肺癌A549细胞的迁移能力。
　　4.Western blotting表明：TBrC-L和TBrC+P-L能够上调抑制生长和诱导凋亡的相关蛋白因子Bax、PARP-1和caspase-3的表达水平，下调促进生长和迁移以及抗凋亡的相关蛋白因子VEGFR1、Bcl-2、Akt、NF-κB蛋白的表达水平。
　　结论：TBrC-L和TBrC+P-L对人肺癌A549细胞的生长和迁移有显著的抑制作用，并且TBrC+P-L的抑制作用更强；促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长和迁移可能是其作用重要的分子机制，其中涉及到的蛋白因子包括Bcl-2、Bax、PARP-1、caspase-3、VEGFR1、Akt以及NF-κB等。
　　创新点：
　　1.制备成茶溴香酰胺脂质体，并与紫杉醇制备成复方脂质体。
　　2.首次探究了TBrC-L和TBrC+P-L对人肺癌A549细胞生长和迁移的抑制作用
　　3.初步证明了TBrC-L和TBrC+P-L抑制人肺癌A549细胞生长和迁移可能作用的分子机制，并证实其作用相关的重要蛋白因子。

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符号说明

1 前 言

1.1 肺癌的研究现状

1.1.1 中药治疗肺癌的研究现状

1.1.2 肺癌靶向治疗的研究现状

1.2 茶氨酸的概况

1.3 紫杉醇的概况

1.4 脂质体的研究进展

2 TBrC-L和P-L的处方工艺研究和质量评价

2.1 仪器与试剂

2.1.1 仪器

2.1.2 药品与试剂

2.2 实验方法与结果

2.2.1 TBrC的HPLC含量测定方法的建立

2.2.2 紫杉醇的HPLC含量测定方法的建立

2.2.3 包封率的测定

2.2.4 脂质体的制备

2.2.5 TBrC-L和P-L制备处方的单因素考察

2.2.6 最佳处方工艺的验证

2.2.7 TBrC-L和P-L的药剂学性质研究

2.3 本章小结

3 TBrC+P-L的处方工艺研究和质量评价

3.1 仪器与试剂

3.1.1 仪器

3.1.2 药品与试剂

3.2 实验方法与结果

3.2.1 TBrC+P-L的制备

3.2.2 TBrC+P-L制备处方的单因素考察

3.2.3 最佳处方工艺的验证

3.2.4 复方脂质体的药剂学性质研究

3.3 本章小结

4 TBrC-L和TBrC+P-L体外抗肺癌活性研究

4.1 实验材料

4.1.1 实验细胞株和试剂

4.1.2 实验仪器

4.2 实验方法

4.2.1 细胞培养

4.2.2 MTT法检测TBrC-L和TBrC+P-L对人肺癌A549细胞生长的影响

4.2.3 流式细胞术检测TBrC-L和TBrC+P-L对人肺癌A549细胞的凋亡的影响

4.2.4 体外迁移实验

4.2.5 Western Blotting法检测药物对细胞中相关蛋白表达水平的影响

4.3 统计学处理方法

4.4 实验结果

4.4.1 TBrC-L和TBrC+P-L对人肺癌A549细胞生长的抑制作用

4.4.2 TBrC-L和TBrC+P-L对人肺癌A549细胞凋亡的影响

4.4.3 TBrC-L和TBrC+P-L对人肺癌A549细胞迁移的影响

4.4.4 TBrC-L和TBrC+P-L对A549细胞中凋亡相关蛋白表达的影响

4.4.5 检测细胞中抗凋亡、促进生长及迁移相关蛋白表达的影响

4.5 讨论

4.5.1 TBrC-L和TBrC+P-L对人肺癌A549细胞生长的影响

4.5.2 TBrC-L和TBrC+P-L对人肺癌A549细胞凋亡影响

4.5.3 TBrC-L和TBrC+P-L对人肺癌A549细胞迁移的影响

4.5.4 TBrC-L和TBrC+P-L对人肺癌A549细胞中凋亡相关蛋白表达水平的影响

4.5.5 TBrC-L和TBrC+P-L对细胞中抗凋亡、促进生长相关蛋白的影响

4.5.6TBrC-L和TBrC+P-L对细胞周期相关蛋白Cyclin D1表达的影响

5 结 论

参考文献

附录1攻读学位期间论文发表的目录

致谢

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