基于基因组扫描的新型天然产物发现

摘要

天然产物的生物合成是一个从简单的小分子前体到终产物形成的多步骤反应，每一步反应都有特定的酶蛋白催化，需要多个不同功能的酶顺序协作，参与化合物化学结构合成的全过程。研究发现，参与复杂天然产物生物合成的基因，包括结构基因、调节基因和抗性基因在内，通常特征性地成簇分布于微生物染色体的某一区域。如果克隆到一个基因，并证明其与目标分子的产生有关，就可以通过染色体步移的方法克隆整个生物合成基因簇。
　　 抗生素生物合成基因簇的克隆策略有多种，本课题是运用高通量基因组扫描的方法。与同源基因杂交和PCR扩增不同，基因组扫描的方法不依赖于微生物是否产生某种特定的天然化合物，所克隆到的生物合成基因簇可能编码结构未知的天然产物合成。因此，这为发现某种特定微生物可能具有的生物合成潜力，并直接切入感兴趣的生物合成途径的研究工作提供了一种有效的手段。
　　 我们首先提取高质量的总DNA作为PCR扩增反应的模板，根据非核糖体聚肽合成酶(NRPS)、Ⅰ型重复聚酮合成酶(PKS)、糖N，N-二甲基转移酶和硫肽环化脱水酶基因的保守区域设计了五对简并性引物。利用第一对简并性引物克隆到了阿嗪霉素B还原性多肽合成酶PCP-RE结构域，有效的验证了此方法的可行性。然后对于我们实验室现有的和上海交通大学提供的菌种总DNA（约有100种）作为模板进行高通量的筛选，通过不断的更改PCR反应成分和体系，摸索到了最佳的PCR反应条件，将扩增到的片段测序并在GenBank数据库中比对，结果显示所得到的PCR产物都与预期的扩增产物具有较高的同源性（包括7个还原性聚肽合成酶基因、5个聚酮合成酶基因、1个糖基N，N-二甲基转移酶基因和10个硫肽环化脱水酶基因），并且没有发现序列等同的基因，表明这些PCR产物结构基因可能参与了某些新型抗生素的生物合成。
　　 利用微生物抗生素生物合成基因簇克隆、测序和功能分析的最新成果，根据关键基团的合成基因的保守序列设计兼并性引物，规模性地筛选我国丰富的放线菌菌种资源，获得新型抗生素生物合成基因簇资源，继而在新基因功能分析的基础上，利用自己发展的不同类型抗生素产生菌的成熟遗传操作体系，通过组合生物合成方式鉴定和挖掘新颖性结构基因，并产生多种杂合抗生素。
　　 在抗生素生物合成途径中，含有相似结构特征的单元可能采用相似的酶学机制来形成。在蛋白和基因水平，这种相似性则体现在酶蛋白和结构基因的序列保守性上。通过上述实验结果，表明针对相似结构特征单元的合成机制设计特异性的克隆策略，是切入特定抗生素生物合成途径研究的有效出发点。
　　 可以预期，采用以序列分析为基础的基因组扫描的手段可以充分发掘微生物来源天然产物的潜力，将是发现新型天然产物的一种有效的新方法。

目录

文摘

英文文摘

符号和缩写

第一章 绪论

第一节 天然产物是药物发展的主要来源

第二节 天然产物的生物合成和组合生物合成研究

第三节 本研究领域（基因组扫描）国内外发展现状与趋势

第四节 主要研究内容及所要解决的难点

第五节 课题的实用价值与理论意义

第六节 本文的研究方法和技术路线

第二章 材料与方法

第一节 实验材料

第二节 实验方法

第三章 结果与讨论

第一节 PCR模板制备、基因组总DNA的提取和检测

第二节 简并性引物的设计

第三节 还原性多肽合成酶基因PCP-RE结构域简并性引物有效性验证

第四节 高通量筛选，PCR扩增

第五节 小结

第四章 总结

致谢

参考文献

附录

硕士论文期间发表论文情况