基于胶原/Matrigel支架材料的工程化心肌组织构建及体内移植的实验研究

摘要

缺血性心脏疾病是威胁人类健康的头号杀手之一。心肌梗死伴随着功能性心肌细胞大量死亡，最终导致心力衰竭。针对心衰晚期患者，心脏移植手术是目前临床治疗的唯一选择。但因存在供体器官短缺、免疫排斥反应及一系列移植后并发症等问题，而无法在临床广泛应用，急需寻找新的有效治疗方法和手段。组织工程这门交叉学科的兴起，为根治心脏疾病带来了希望。
　　 近年来，心肌组织工程研究进展迅速。国内外相继以新生大鼠心肌细胞、间充质细胞、胚胎干细胞(ESC)源心肌细胞为种子细胞，在体外成功再造了工程化心肌组织，再造心肌组织具有节律性收缩特性，并在组织结构方面与正常新生在体心肌组织相类似。尽管如此，目前心肌组织工程仍面临种子细胞来源选择、如何优化心肌细胞-支架材料体外培育环境，以及如何提高再造心肌组织的质量等一系列关键问题。
　　 从国内外研究现状分析，Zimmermann等利用胶原/Matrigel为支架体外构建心肌这一实验体系最为成功。但是该体系作为心肌体外再造模型采用的是动态力学拉伸，作为体外心肌再造研究模型的稳定性和可靠性尚有待提高。此外，随着相关研究的不断深入，研究人员对如何实现工程化组织体外血管化、以及针对再造心肌组织中非心肌细胞成分对再造心肌组织质量和心肌细胞体外三维重构的影响给予了越来越多的关注。与此同时，本室以往利用该实验体系，以ESC源心肌细胞为种子细胞，虽然成功在体外制备了心肌组织，但因获得种子细胞实验流程复杂、费时长而影响了再造心肌效率与质量。
　　 针对以上分析，本研究利用胶原/Matrigel实验体系，开展了基于静态力学拉伸模型下的心肌组织体外再造研究，并通过添加血管内皮细胞的方式，研究了血管内皮细胞提高再造心肌组织的质量的能力;与此同时，利用胶原/Matrigel实验体系，进行了ESC分化发育的研究，重点观察了ESC自发分化发育及向心肌细胞定向诱导分化情况，在此基础上，利用已探索的定向诱导分化条件，研究ESC在本实验体系下进一步分化形成心肌组织的能力，并对其动物心梗修复能力进行研究。
　　 本论文的主要研究内容与结果简要概括如下，共分为以下四个部分：
　　 第一部分：基于静态力学拉伸模型下的心肌组织体外再造研究
　　 再造心肌组织的质量与微环境和非心肌细胞的作用关系密切。其中力学微环境对于再造心肌组织的质量至关重要。目前国内外常见的体外力学拉伸条件以动态力学拉伸为主，该力学拉伸条件存在一定的局限性。相比之下，再造心肌作为心肌体外发育研究模型，静态力学拉伸具有明显的优势，其稳定性和可靠性均较高。此外，近年来发育生物学研究表明，心肌中非心肌细胞成分对心肌细胞三维重构与心脏功能的发挥均起着重要作用，尤其是针对Telocytes细胞在心脏发育中作用的研究，是目前研究的热点之一。
　　 在本部分研究中，首先建立了基于胶原/Matrigel三维立体静态力学拉伸体系；其次，利用该体系，以新生大鼠心肌细胞为种子细胞，成功在体外构建了工程化心肌组织片层。在此基础上，通过组织学染色及免疫组织化学染色，对体外再造心肌组织中是否存在Telocytes细胞进行检测，并对其在心肌细胞三维重构与心脏功能发挥中的作用进行探讨。研究结果分别简要介绍如下。
　　 在基于胶原/Matrigel三维立体静态力学拉伸体系建立方面：研究结果表明，静态力学拉伸抵抗了胶原凝胶在细胞存在时的强烈收缩，避免了由于过度收缩而引起的组织变厚，防止了材料中央部位细胞的大量死亡。在实施静态力学拉伸后，再造心肌组织在体外始终维持一定的形状和厚度，形成较均一的组织片层。
　　 在工程化心肌组织片层制备方面：研究结果表明，心肌细胞在胶原/Matrigel三维立体静态力学拉伸体系中，排列形成致密的肌纤维束，沿着静态拉伸力的方向充分伸展。激光共聚焦观察发现，可见心肌细胞相互连接部位部分区域存在Connexin43阳性染色，说明心肌细胞之间形成功能合胞体。此外，透射电镜结果表明工程化心肌组织中，心肌细胞肌小节排列具有方向性，并且可以观察到与细胞机械收缩和电信号传导密切相关的超微结构，如缝隙连接、桥粒等。
　　 在工程化心肌组织中是否存在Telocytes细胞方面：组织学染色可以观察到再造心肌组织中存在一种长梭形细胞，具有两个或三个长细胞突起，形态上与Telocytes细胞相似。此外，免疫组织化学染色结果表明，这类长梭形细胞表达SMA阳性、Vimentin阳性和CD117阳性。根据以上实验结果，我们初步判定在工程化心肌组织中可能存在Telocytes细胞。
　　 第二部分：组织工程化心肌体外血管化研究
　　 再造组织血管化研究一直是组织工程包括心肌组织工程研究关注的焦点。近年来国内外研究报道表明，血管内皮细胞在三维支架材料中可形成血管样结构，并且血管内皮细胞还对心肌细胞体外空间重构、存活和提高再造心肌组织的质量发挥重要作用。本部分研究，在前期建立基于胶原/Matrigel支架材料构建工程化心肌组织的基础上，进一步在凝胶体系中将血管内皮细胞与心肌细胞复合，深入研究了血管内皮细胞对心肌组织血管化能力和提高心肌组织质量的促进作用。
　　 研究结果表明，复合了血管内皮细胞的组织工程化心肌中，血管样结构形成明显增加，可见较多vWAg阳性的血管内皮细胞排列形成条索样结构。此外，血管内皮细胞还对心肌细胞空间排布上产生影响，cTnT和vWAg荧光双标记激光共聚焦检测发现，心肌细胞与血管内皮细胞在空间上相互靠近，心肌细胞更偏向于在血管内皮细胞网中存在。此外，加入血管内皮细胞还可以稳定再造心肌组织结构，提高再造心肌组织的收缩能力。
　　 第三部分：ESC在胶原/Matrigel支架材料中分化发育的实验研究
　　 在ESC分化发育研究中，拟胚体(EBs)的形成对于ESC分化发育发挥着重要作用。现有ESC分化发育研究体系多是将ESC形成EBs与EBs进一步分化发育这一连续过程分割为两个阶段：首先是在二维或三维环境中形成EBs，随后将所形成的EBs二维贴壁诱导分化或接种在三维支架材料中进一步诱导分化。
　　 在本研究中，基于胶原/Matrigel这一实验体系在心肌再造方面取得的良好结果和建立的平台条件，将ESC以单细胞形式直接接种在胶原/Matrigel支架材料中，进而观察EBs形成以及后续分化发育情况，从而探讨胶原/Matrigel对ESC在三维立体环境中直接形成EBs的可行性。重点针对ESC接种密度对EBs形成的影响、不同支架材料组成对EBs形成与分化的影响以及ESC在本体系下自发分化情况进行了研究。
　　 其中，在ESC接种密度对EBs形成影响的研究方面，结果表明ESC在胶原/Matrigel支架材料中可以直接启动EBs形成，并且ESC接种浓度对EBs形成具有明显影响，其最佳接种密度在105个/ml至106个/mL之间。在这一密度范围内，ESC所形成的EBs数量多、体积大。在不同支架材料组成对EBs形成与分化的影响研究方面，将ESC分别在单纯胶原凝胶及胶原/Matrigel不同体系中培养发现，支架材料中的胶原凝胶成分主要影响EBs形成，而Matrigel成分则对EBs分化发育与发挥重要作用。在ESC自发分化研究方面，将ESC在胶原/Matrigel三维立体环境中培养，在不施加任何诱导条件的情况下，通过组织学染色结果表明，体外培养21d后EBs自发分化形成了与在体结构类似的各种组织结构，如有心肌细胞合胞体样结构、管腔样结构形成。针对CK18、CD31、cTnT、Nestin等免疫组织化学染色结果证实，ESC可以分化为cTnT阳性的心肌细胞、CK18阳性的上皮细胞、CD31阳性的内皮细胞以及Nestin阳性细胞等。
　　 第四部分：基于ESC为种子细胞的心肌组织构建及体内移植的实验研究
　　 在本部分研究中，利用我室在心肌组织工程研究方面既有的研究平台和技术体系，在前期利用胶原/Matrigel进行ESC定向体外分化研究的基础上，探索了ESC进一步定向诱导分化并形成心肌组织的能力及其动物心梗修复能力。
　　 ESC在本体系下是否可以通过特定诱导条件而向心肌细胞分化进而形成心肌组织是本论文研究关注的焦点之一。在本部分研究中，通过添加抗坏血酸作为ESC向心肌细胞分化的诱导剂，进行了ESC体外定向诱导分化及心肌组织三维再造研究，并对再造组织进行了组织学及免疫组织化学鉴定。在此基础上，将所构建的工程化心肌组织移植到心梗部位，观察其在心梗部位存活、分化，及对心功能的改善情况。
　　 研究发现ESC在胶原/Matrigel支架材料中培养10-11d时(诱导3-4d)分化形成大量跳动的细胞，并且随着培养时间的延长，跳动细胞的数量和面积逐渐增多，14d(诱导7d)左右可见形成大面积跳动区域，体外培养19d(诱导12d)左右出现一致性跳动区域。对其进行免疫组织化学染色证实，再造心肌组织中含有大量表达cTnT、Nkx2.5和GATA4阳性的心肌细胞。与向心肌细胞自发分化相比，诱导分化后cTnT阳性细胞的大量增多，提示抗坏血酸显著促进了ESC向心肌细胞分化。并且，随着再造心肌组织中心肌细胞逐渐成熟，可见心肌细胞相互连接部位部分区域存在Connexin43阳性染色。免疫组织化学染色同时还揭示了在再造心肌组织中存在ESC分化来源的Nestin阳性细胞和CD31阳性细胞。
　　 将上述体外再造心肌组织进行心梗部位移植，并将单纯心梗组和非收缩片层移植组作为对照组。移植术后4w进行心功能检测，结果表明，与单纯心梗组和非收缩片层移植组相比，工程化心肌组织移植组可以显著改善梗死心肌的收缩及舒张功能。组织切片染色观察显示工程化心肌组织片层紧密贴附于梗死心肌部位，并已在结构上与宿主心肌发生整合，两者之间界限不明显。此外，针对心肌特异性标志cTnT，Nkx2.5，GATA4，connexin43免疫组织化学检测结果显示，再造工程化心肌组织中存在具有分化心肌细胞表型的细胞，并且Connexin43染色结果表明工程化心肌组织及工程化心肌组织与宿主心肌细胞之间形成了较广泛的细胞间连接。CD31染色结果显示在移植的工程化心肌组织中存在较丰富的血管内皮细胞，并且形成了管腔样结构。在此基础上，对工程化心肌组织移植后畸胎瘤形成情况进行了检测。移植4w后，开胸观察畸胎瘤形成。工程化心肌组织移植组移植后会引起畸胎瘤发生，发生率在25％(3+/12)，形成的畸胎瘤位于心肌梗死部位，具有一定肉眼可见的体积，而在动物胸腔和腹腔均未检测到畸胎瘤形成。所形成的畸胎瘤包含典型的三胚层结构。
　　 综上所述，本论文以胶原/Matrigel为支架材料，在体外建立了三维立体静态力学拉伸体系，并利用该体系，以新生大鼠心肌细胞为种子细胞，体外构建了工程化心肌组织片层，并对再造心肌组织中是否存在Telocytes细胞进行研究。此外，通过将血管内皮细胞与心肌细胞复合在胶原/Matrigel支架材料中，进一步研究了再造心肌组织血管化能力。在此基础上，基于静态力学拉伸体系，以胶原/Matrigel为支架材料，建立了ESC体外分化发育模型，开展了ESC三维立体分化与体外心肌再造研究，并将所构建的工程化心肌组织移植到心梗部位探索其动物心梗修复能力，结果表明，工程化心肌组织片层能够与宿主发生整合，并改善受损心肌功能。