啮齿动物螺杆菌多重PCR检测方法的建立及流行病学调查

摘要

啮齿动物螺杆菌是指寄居于啮齿动物消化道的一群螺杆菌属细菌，主要定植部位为盲肠、结肠及肝胆管系统。目前从大鼠、小鼠、沙鼠等啮齿类实验动物中已陆续分离到至少13种啮齿动物螺杆菌，其中H.hepaticus、H.bilis、H.rodentium为较为重要的感染啮齿动物的螺杆菌。
　　 啮齿动物普遍存在螺杆菌自然感染并主要以隐性感染形式存在。因此，若使用隐性携带螺杆菌的动物进行致病机理、药物筛选以及药效学等研究时，必然会干扰实验结果。啮齿动物螺杆菌的感染调查已有一些报道，目前的检测方法主要包括分离培养、免疫学检测、PCR等多种方法。本实验通过建立一种敏感、可靠的多重PCR方法对上海及周边地区的实验用兔、大鼠、小鼠、豚鼠、金黄地鼠等螺杆菌携带情况进行检测，以深入了解螺杆菌在啮齿动物上的分布情况。
　　 1.H.hepaticus、H.bilis、H.rodentium多重PCR检测方法的建立:为了更灵敏、特异、快速、高效的检测实验动物中3种螺杆菌的感染情况，本实验根据已公布的H.hepaticus、H.bilis、H.rodentium16SrRNA基因序列设计3对特异性引物，从而建立一种可同时检测H.hepaticus、H.bilis、H.rodentium的多重PCR方法。优化后的多重PCR体系表明:3对引物能分别扩增出特异性的417bp、364bp、324bp目的条带。最佳退火温度为52℃，镁离子浓度为2.0mM，dNTP浓度为200μM，引物浓度为0.625μM。在此条件下多重PCR同时检测的H.hepaticus、H.bilis、H.rodentium敏感度均为10fg。由此可得，本实验建立的多重PCR是一种敏感、特异、高效的方法，为同时检测啮齿动物中H.hepaticus、H.bilis、H.rodentium奠定了良好的基础。
　　 2.上海及周边地区啮齿动物螺杆菌流行病学调查:采用单重PCR、多重PCR对上海及周边地区的啮齿动物螺杆菌感染情况进行调查。调查结果表明，上海及周边地区啮齿动物均存在不同程度的螺杆菌感染，普通级和清洁级的实验用兔螺杆菌感染率均较低，且实验用兔、豚鼠不同饲养环境，螺杆菌感染率也有明显区别。金黄地鼠、大鼠、小鼠普遍感染螺杆菌。多重PCR检测结果显示，在豚鼠和大鼠中，H.rodentium带菌率明显高于其他两种。小鼠中H.hepaticus和H.rodentium百分率略高于H.bilis，混合感染数量也较多。金黄地鼠样品数量较少，可作为参考。此外，在对大、小鼠分型统计汇总中发现，转基因小鼠螺杆菌感染率极高，接近100％，可能是因为正常基因序列被破坏而易感。

目录

声明

摘要

符号说明

绪论

1．前言

2．螺杆菌简介

2．1 螺杆菌概述

2．2 啮齿动物螺杆菌

3．菌株分型及其致病性

3．1 H．hepaticus

3．2 H．bilis

3．3 H．rodentium

4．分子生物学研究进展

5．啮齿动物螺杆菌流行病学

5．1 国际流行情况

5．2 国内流行情况

6．实验室诊断技术

6．1 分离培养

6．2 免疫学方法

6．3 PCR检测

7．啮齿动物螺杆菌的防治

8．发展趋势

9．研究目的及意义

第一章 啮齿动物螺杆菌多重PCR检测方法的建立

1 实验材料

1．1 质粒

1．2 试剂

2 实验方法

2．1 质粒DNA抽提

2．2 引物的设计与合成

2．3 单重PCR

2．4 多重PCR

3 实验结果

3．1 单重PCR

3．2 多重PCR反应体系和条件的优化

3．3 多重PCR特异性试验

3．4 多重PCR敏感度试验

4 讨论

第二章 上海及周边地区啮齿动物螺杆菌流行病学调查

1 实验材料

1．1 样品采集

1．2 实验试剂

1．3 引物

2 实验方法

2．1 回盲内容物处理

2．2 细菌DNA抽提

2．3 通用引物PCR检测

2．4 多重PCR检测

2．5 克隆测序

3 实验结果

3．1 通用引物PCR结果

3．2 多重PCR实验结果

3．3 测序结果

4 讨论

参考文献

致谢

论文说明

攻读硕士期间发表的论文

附录