ATPllC基因诱捕小鼠遗传背景的研究

摘要

Atp11c作为脂类的翻转酶，在新陈代谢和机体免疫等多种生命活动中起重要作用。目前研究证实Atp11c对淋巴B细胞的分化和体内胆汁转运起关键作用;同时Atp11c缺陷会导致个体体重降低和雌性难产等症状，显示Atp11c可能对生长发育起调节作用，但缺乏有力的证据来证明。本研究希望通过基因诱捕技术构建Atp11c基因诱捕小鼠模型来解决这个问题。基因诱捕技术是研究基因在生物体内功能最经济有效和快速直接的方法，但是基因诱捕技术有一定缺陷，会出现如诱捕载体片段缺失、宿主染色体大片段删除和野生型转录本表达的状况。因此，在通过构建Atp11c基因诱捕小鼠模型来研究Atp11c在体内生物学功能之前，必要前提是研究Atp11c诱捕小鼠的遗传背景。
　　 本实验利用Atp11c基因诱捕嵌合体小鼠与纯和129小鼠构建基因诱捕小鼠模型，分析敲除小鼠的遗传背景并结合其生长发育状态，阐述Atp11c基因诱捕小鼠的生理状态。通过PCR技术，确定诱捕载体在Atp11c第一个内含子中位置;测序结果显示伴随着基因诱捕载体两端的部分缺失，宿主染色体片段出现不规律的删除。利用荧光竞争性PCR技术检测整合到宿主染色体内的诱捕载体为单拷贝。然而在体重增长和性发育等表型方面，Atp11c基因诱捕小鼠与纯和129小鼠无明显差异。本研究利用半定量逆转录PCR检测Atp11c表达模式，发现诱捕载体元件没有发挥应有作用，出现野生型和变异野生型转录本，导致Atp11c基因诱捕小鼠在表型上与正常小鼠无差异。这可能是因为诱捕载体在体内不被识别而出现选择性剪切或者Atp11c在体内功能过于重要导致补偿性剪接以确保Atp11c在体内的表达。
　　 在基因组水平上，本实验成功验证了基因诱捕载体整合在Atp11c基因第一个内含子中。确定了基因诱捕载体的插入位置并精确检测了宿主染色体的缺失状态。同时通过对Atp11c基因诱捕小鼠表达谱的分析，发现了多种转录本并存的现象，说明Atp11c基因诱捕小鼠在功能方面并未达到预期的敲除目的，证明了基因诱捕技术具有不确定性。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 Atp11c基因和基因诱捕技术的研究现状

1．1．1 Atp11c的简介

1．1．2 Atp11c功能研究进展

1．1．3 基因诱捕小鼠策略的研究现状

1．2 立题背景

1．2．1 基因诱捕小鼠在研究人类复杂疾病中的优势

1．2．2 Atp11c作为性发育相关候选基因

1．3 研究思路

1．3．1 前期工作

1．3．2 Atp11c基因诱捕小鼠模型的构建

1．3．3 技术路线

1．4 研究意义

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 小鼠饲养

2．1．2 实验仪器与试剂

2．1．3 软件与网络资源

2．2 方法

2．2．1 小鼠生长和性发育的性状鉴定

2．2．2 小鼠基因组DNA制备、检测及定量

2．2．3 诱捕载体插入区段和染色体缺失区段检测

2．2．4 荧光竞争性PCR

2．2．5 小鼠组织RNA制备、检测及定量

2．2．6 逆转录PCR检测Atp11c表达

第三章 结果与分析

3．1 Atp11c基因诱捕小鼠生长曲线和性发育性状

3．1．1 Atp11c基因诱捕小鼠生长曲线的制作

3．1．2 Atp11c基因诱捕小鼠性发育启动鉴定

3．2 Atp11c基因诱捕小鼠遗传背景分析

3．2．1 基因诱捕载体插入位点和染色体序列缺失检测

3．2．2 Atp11c基因诱捕载体拷贝数检测

3．3 Atp11c基因在诱捕小鼠体内表达模式

3．3．1 RNA质量检测

3．3．2 Atp11c基因表达模式

第四章 讨论

4．1 诱捕载体的缺失和插入定位的确定

4．2 诱捕载体拷贝数的鉴定

4．3 基因诱捕个体Atp11c表达模式

第五章 结论与展望

参考文献

硕士研究生阶段发表论文

致谢