次壶腹腺丝蛋白功能模块的研究

摘要

蜘蛛丝是一种理想的生物材料，具有很大的潜在应用价值。由于蜘蛛纺丝量少以及互相残杀的天性，不能像家蚕那样通过大规模、密集饲养的方式来获取大量的蜘蛛丝蛋白纤维。因此，采用生物技术的方法重组表达蜘蛛丝蛋白以及后续的仿生成为一种重要策略。为了实现这个目标，我们除了找到合适的宿主表达高分子量蜘蛛丝蛋白外，还需要了解蛛丝蛋白的分子结构、自组装机制以及纤维形成的影响因素等等，即成丝机理。
　　次壶腹腺丝蛋白(Minorampullatespidroin，MiSp)由蜘蛛次壶腹腺分泌，由N末端、C末端以及大量重复区R组成。N、C末端呈高保守性，可以感受不同的环境变化来调节蛛丝蛋白的组装和成丝，重复区则主要与丝的性能相关。另外，研究发现，蜘蛛的腺体中还存在大量的氯化钠，这可能对丝纤维的形成具有较重要的作用。
　　为了进一步研究次壶腹腺丝蛋白MiSp功能模块在不同离子、pH条件下的聚集和成丝特性，以及在不同pH条件下的二级结构变化，以探究成丝机理。本课题主要开展了如下工作:
　　本实验以大腹园蛛MiSp蛋白N、C和Spacer为研究对象，构建R1R2、R1SR2、R1R2CT、R1SR2CT、NTR1R2CT、NTR1SR2CT六个重组克隆;
　　以上克隆在大肠杆菌Rosetta2(DE3)宿主细胞中融合表达;
　　借助Ni-NTA亲和色谱纯化，得到纯度较高的重组蛋白;
　　利用圆二色谱(Circulardichroism，CD)测定并比较分析了不同pH条件下的六个重组蛋白二级结构特性;
　　采用扫描电镜(Scanningelectronmicroscope，SEM)分析测试R1R2CT和R1R2重组蛋白在不同pH及离子条件下的聚集和成丝情况，为进一步研究成丝机理奠定基础。
　　针对以上几个方面的研究，都取得良好的结果:
　　(1)NT、CT、R1R2以及Spacer由(I)型限制性内切酶BsaⅠ介导无缝拼接，成功构建R1R2、R1SR2、R1R2CT、R1SR2CT、NTR1R2CT、NTR1SR2CT六个蜘蛛丝蛋白重组模块，经测序鉴定，插入序列无突变;
　　(2)由于蜘蛛丝重复区含有大量的甘氨酸以及丙氨酸等重复区氨基酸，本次实验中使用了表达菌株Rossta2(DE3)，由于该菌株含有稀有密码子的tRNA，以上各模块表达情况良好;
　　(3)由于蜘蛛丝MiSp间隔区(Spacer，S)自身氨基酸组成及结构的影响，纯化过程中易成丝。实验中含有S区的重组模块蛋白经Ni-NTA亲和色谱纯化后需加大洗涤液的咪唑浓度以提高蛋白纯度;
　　(4)由于Spacer的存在，纯化的重组蛋白R1SR2、R1SR2CT、NTR1SR2CT蛋白较不稳定，CD信号波动性较大，结构特征峰不是很明显。由于六个重组蛋白的氨基酸组成不同，CD呈现不同的峰图特性。R1R2主要是无规卷曲(randomcoil)结构，从pH7.5到pH5.5，randomcoil结构减少，α-helix或者β-sheet结构增多。S、NT以及CT三个结构域都与螺旋结构相关。NTR1R2CT的峰型最明显，但是在pH7.5的时候在195nm的位置有负峰，表示有randomcoil结构的存在，随着pH到达5.5，randomcoil基本消失，该蛋白全部折叠成α-helix结构。重组蜘蛛丝蛋白R1R2在pH7.5、6.5和5.5时二级结构相似，均为无规则卷曲，而R1R2CT则主要呈现为α螺旋构象。在pH从7.5到5.5转变的过程中，NT和CT可以促进二级结构从randomcoil向α-helix或者β-sheet的转变。
　　(5)通过SEM扫描电镜的方法研究两个重组模块蜘蛛丝蛋白在不同的pH和离子环境中聚集以及成丝情况。37℃250r/min震荡培养R1R2CT和R1R2两种重组蛋白12小时，只有当pH5.5时R1R2和R1R2CT才形成重组丝纤维，R1R2CT纤维形态较平整，类似于天然的蛛丝纤维形态，而R1R2丝纤维则呈条带状，表面粗糙。实验表明，氯化钠不利于形成表面形态平整的丝纤维。该成果为研究蛛丝蛋白的成丝机理奠定基础，也为制备仿生蛛丝蛋白纤维提供理论依据。
　　综上所述，本课题通过不同蜘蛛丝蛋白模块的组合，在不同的离子、pH条件下利用圆二色谱、扫描电子显微镜进行测试，表征了重组模块蛋白在不同pH条件下的二级结构变化以及在不同离子和pH条件下的纤维形态，后续还需要通过增加剪切力等条件进一步探索蛋白聚集以及成丝机理。本论文对蜘蛛的成丝机理具有一定的推测，对于形成蜘蛛丝纤维的条件进行了一系列的摸索，为以后通过基因工程的方法仿生蜘蛛丝蛋白提供了线索。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 绪论

1．1 前言

1．2 蜘蛛丝的种类及腺体特征

1．3 蜘蛛丝结构特征

1．4 蜘蛛丝自组装机理

1．5 蜘蛛丝的性能

1．6 蜘蛛丝的应用

1．7 本课题研究的内容和意义

第二章 实验材料、基本技术和设计方案

2．1 材料和仪器

2．2 实验基本技术

2．3 实验方案

第三章 实验过程

3．1 以R1R2-NTR1SR2CT一系列克隆的构建

3．2 蛋白表达、纯化以及Western blot检测

3．3 R1R2、R1SR2、R1R2CT等重组蛋白不同条件下CD

3．4 R1R2、R1R2CT重组蛋白不同条件下SEM

第四章 实验结果与分析

4．1 R1R2、NTR1SR2CT一系列克隆的构建

4．2 各重组模块蛋白表达纯化结果

4．3 重组蛋白二级结构测定

4．4 SEM扫描电镜分析

第五章 分析讨论

5．1 Bsal酶介导无缝连接构建克隆

5．2 表达菌体的选择

5．3 包涵体洗涤和蛋白纯化

5．4 不同模块蛛丝蛋白pH感应下的二级结构

5．5 扫描电子显微镜表征纤维形态

5．6 展望

参考文献

硕士期间发布论文和参加科研情况说明

致谢

附录一