表达海栖热袍菌内切1,4-β-甘露糖苷酶的工程菌构建及发酵条件优化

摘要

近二十年来，来源于极端环境微生物及其产生的极端环境酶，已经成为很多领域的研究热点。糖苷酶是工业生产中不可缺少的重要酶类，而内切1,4-β-甘露糖苷酶在食品、制药、饲料、纤维制造等领域更是有着重要的工业应用价值。因此，开发耐热内切1,4-β-甘露糖苷酶对工业生产具有重大的研究意义。海栖热袍菌（Thermotoga maritime）是极端嗜热微生物的一种，生长条件十分苛刻，大规模的发酵培养用于工业化生产十分困难。利用基因工程技术对海栖热袍菌的耐热酶基因进行克隆并高效表达，得到需要的耐热酶是人们利用海栖热袍菌的主要方法。
　　本课题主要研究了海栖热袍菌中的内切1,4-β-甘露糖苷酶。采用分子生物学手段构建得到表达内切1,4-β-甘露糖苷酶的基因工程菌，通过热处理的方式去除大量杂蛋白，便于纯化，操作简单。同时，对酶产量的发酵条件进行优化，有利于后续的工业生产研究，本文的主要研究内容及结果如下：
　　1.选用海栖热袍菌（Thermotoga maritima）内切1,4-β-甘露糖苷酶（MSB8-898257）基因的克隆片段、以pET-28a(+)质粒为表达载体，大肠杆菌BL21为表达系，得到表达海栖热袍菌内切1,4-β-甘露糖苷酶的工程菌。
　　2.采用IPTG作为诱导剂，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、考马斯亮蓝染色、蛋白免疫印迹等方法进行检测，在77 kDa左右处出现目的条带，验证目的蛋白成功表达。
　　3.利用生物信息学软件，进行目的蛋白理化性质分析；DNS法检测酶活性；Ni-NTA树脂进行目的蛋白纯化，得到较纯的目的蛋白，并对目的蛋白的诱导条件进行了优化。
　　4.通过摇瓶培养试验考察BL21-898257基因工程菌的发酵条件并进行优化。主要考察温度、pH、诱导剂浓度、诱导培养时间、诱导起始OD600值。结果发现，培养温度、时间、起始OD600值对目的蛋白的表达量影响较为明显。并根据试验结果，设计正交实验方案，进行1L发酵液的发酵条件优化。得到最佳发酵条件为：培养温度32℃，在OD600达到1时加入0.2 mM诱导剂，诱导培养时间为7 h，收获菌体。每升发酵液可获得5 mg左右的酶蛋白表达量。
　　5.通过初步的脱胶效果分析，进行重组酶的应用探究。结果表明：重组酶脱胶效果显著，在纺织纤维制造工业里有很好的应用价值。

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第一章 绪论

1.1 嗜热微生物及极端环境酶

1.2内切1,4-β-甘露糖苷酶

1.3大肠杆菌表达系统及融合表达

1.4本课题研究意义及内容

第二章 含有内切1,4-β-甘露糖苷酶的基因工程菌构建

2.1实验设备、实验材料和实验试剂

2.2实验原理与方法

2.3结果与分析

2.4结论

第三章 目的蛋白的表达、纯化及酶活性检测

3.1实验设备、实验材料和实验试剂

3.2实验原理与方法

3.3结果与分析

3.4结论

第四章、工程菌发酵条件优化及应用

4.1实验设备、实验材料和实验试剂

4.2实验方法

4.3结果与分析

4.4结论

第五章 总结与展望

5.1总结

5.2展望

参考文献

攻读学位论文期间研究成果及所获奖项

致谢