不同保存方法对猪关节软骨细胞存活率及代谢活性的影响

摘要

目的：通过组织培养法、慢速梯度降温保存法和传统慢速连续降温保存法处理离体骨软骨，以新鲜骨软骨组作为对照，比较三种不同方法对关节软骨组织形态、软骨细胞存活率及代谢活性的不同影响。通过比较研究筛选出保存效果较好的方法，为临床提供一种有活性的异体软骨移植物。 方法：取3月龄同种系本地猪10只20膝关节。将供体猪处死后，无菌条件下在髌股关节及胫股关节切取正常骨软骨，制成直径约4.5mm、全长约5mm的圆柱形骨软骨块240枚。将骨软骨块随机分为4组，每组60枚。分别为对照组、组织培养组、慢速梯度降温冷冻保存组、慢速连续降温冷冻保存组。对照组不采取任何处理措施，半小时内直接取材检测软骨细胞存活率及代谢活性。慢速连续降温冷冻保存组采取目前文献报道的程序冷冻法处理保存；慢速梯度降温冷冻保存组是把标本温度降至－40℃以前分4个梯度降温的保存方法；组织培养组将骨软骨块按体积比1：15放入配制的无菌RPMI1640培养液中37℃保存。各实验组软骨标本于保存2、8周时，取出进行组织学、组织化学检测观察软骨细胞代谢活性变化；采用免疫荧光染色的方法检测软骨Ⅱ型胶原表达情况；组织切片FDA—EB双荧光染色测定软骨细胞存活率，以新鲜组作为对照组，对实验组软骨细胞存活率和代谢活性进行比较研究。 结果： 1．关节软骨PG的变化：关节软骨保存2周，实验组PG即开始减少（AOD值），与新鲜组比较，三个实验组PG减少均有统计学意义（P<0.05）；组织培养组和慢速梯度降温冷冻保存组间比较无统计学意义，二者与慢速连续降温冷冻保存组比较有统计学意义（P<0.05）。8周实验组PG与对照组比较均有统计学意义（P<0.05），实验组间两两比较亦均有统计学意义（P<0.05），组织培养法对PG影响最小，慢速梯度降温冷冻保存组其次，慢速连续降温冷冻保存组PG影响最明显。两个时间点实验组内比较，保存处理对PG影响有时间依从性，2周与8周PG含量比较有统计学意义（P<0.05）。 2．关节软骨胶原Ⅱ的变化：在2周时间点，与对照组比较，慢速连续降温冷冻保存组Collagen Ⅱ表达减少有统计学意义（P<0.05），组织培养组和慢速梯度降温冷冻保存组减少无统计学意义（P>0.05）；组织培养组和慢速梯度降温冷冻保存组间比较无统计学意义，二者与慢速连续降温冷冻保存组比较有统计学意义（P<0.05）。保存8周时，与新鲜组比较，三个实验组CollagenⅡ表达均明显减少，均有统计学意义（P<0.05）；三个实验组间比较亦有统计学意义（P<0.05），组织培养组Collagen Ⅱ表达量最多，慢速梯度降温冷冻保存组其次，慢速连续降温冷冻保存组表达最少。两个时间点实验组内比较，保存处理对CollagenⅡ的影响有时间依从性，2周与8周CollagenⅡ含量比较有统计学意义（P<0.05）。 3．软骨细胞存活率的变化：对照组细胞存活率96.22％±0.81％，在2周时间点，组织培养组细胞存活率85.13％±2.11％，慢速梯度降温冷冻组细胞存活率72.49％±2.47％，慢速连续降温冷冻组细胞存活率61.22％±3.32％，三个实验组与对照组比较均有统计学意义（P<0.05），实验组间两两比较，差异有统计学意义（P<0.05）。8周时间点，组织培养组细胞存活率75.53％±2.64％，慢速梯度降温冷冻保存组细胞存％率63.70％±4.11％，慢速连续降温冷冻保存组细胞存活率42.10％±2.93％，三个实验组与对照组比较，差异均有显著统计学意义（P<0.05），三个实验组之间比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。保存处理对软骨细胞存活率的影响具有动态时间依从性：三个实验组内比较，2周时间点细胞存活率和8周时间点细胞存活率差异均有显著统计学意义（P<0.05）。 结论： 1．在37℃条件下，组织培养法可以较长期地在体外保存关节软骨的活性，能够显著提高保存后软骨细胞存活率和代谢能力。组织培养法是一种良好的软骨组织保存方法，有望为临床提供一种新的高生物活性移植材料。但是，移植效果有待进一步体内实验的印证。 2．应用玻璃化冷冻保护液预处理，慢速梯度降温冷冻保存法，与传统冷冻方法比较，能够明显减轻关节软骨组织冻伤，提高保存软骨的活性，有一定的临床使用价值。 3．三种保存方法对关节软骨活性的影响均具有动态的时间依从性。随着保存时间的延长，关节软骨活性逐渐降低。 意义：关节软骨缺损临床上很常见，而且治疗非常棘手，多种治疗手段已运用于关节软骨损伤的修复，但大多数疗效不理想，修复组织也以纤维软骨为多，缺乏正常透明软骨的生物力学性能及耐用性，骨软骨移植可以将完整的正常关节软骨移植于关节缺损处，提供完整的关节软骨基质和有活力的软骨细胞，恢复关节外形，但是目前移植物的保存以连续降温冷冻保存为主，这种方法有明显降低或消除软骨活性的缺点，本实验有望找到新的移植物保存方法，为临床提供新的活性软骨来源，为建立稳定的软骨库提供理论基础。

目录

符号说明

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

展望

附图及说明

参考文献

综述同种异体骨软骨移植修复关节软骨缺损的研究进展

致谢

硕士在读期间发表的文章

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