经鼻靶向中枢导入rhG-CSF对脑梗死大鼠的治疗作用及机理

摘要

研究目的： 1.探讨经鼻靶向中枢导入重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)对脑梗死大鼠行为和神经功能障碍的改善作用。 2.经鼻靶向中枢导入人重组粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)对脑梗死大鼠FasL和HO-1表达的影响。 3.研究rhG-CSF经鼻靶向中枢给药对脑梗死大鼠内源性神经干细胞的增殖、分化及其可塑性的影响。 4.观察经鼻导入rhG-CSF对脑梗死大鼠缺血半暗带皮层神经元细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)及骨架蛋白α-tubulin的影响。 研究方法： 1.线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞模型，缺血2h再灌注。将动物分为正常组、假手术对照组、脑梗死组、脑梗死+皮下注射rhG-CSF组、脑梗死+经鼻生理盐水组、脑梗死+经鼻rhG-CSF组。于术前及缺血再灌注后1d、3d、7d、14d观察动物行为学变化，并进行神经功能评分。 2.采用线栓法制作大鼠可逆性大脑中动脉阻塞模型(MCAO，2h后再灌注)。将60只动物随机分为正常组(n=6)、假手术对照组(n=6)、脑梗死组(n=12)、脑梗死+皮下注射rhG-CSF组(n=12)、脑梗死+经鼻生理盐水组(n=12)、脑梗死+经鼻rhG-CSF组(n=12)。于诱导MCAO后1d、3d固定取材，制备脑组织冠状冰冻切片，用免疫荧光化学技术检测凋亡蛋白配体(FasL)与血红素氧合酶-1(HO-1)在脑内的表达，激光共聚焦显微镜进行图像采集，计数阳性细胞数。 3.运用BrdU标记法检测脑局灶梗死大鼠缺血半暗带皮层、侧脑室下区(SVZ)与海马齿状回颗粒细胞层下区(SGZ)内源性神经干细胞的增殖情况，运用荧光双标法检测BrdU+/GFAP+、BrdU+/NeuN+、BrdU+/PSA-NCAM+在脑内的表达，激光共聚焦显微镜进行图像采集，计数阳性细胞数，确定其分化方向及可塑性。 4.采用线栓法制作MCAO模型(2h后再灌注)。将36只动物随机分为正常组、假手术对照组、脑梗死组、脑梗死+皮下注射rhG-CSF组、脑梗死+经鼻生理盐水组、脑梗死+经鼻rhG-CSF组，n=6。于诱导MCAO后1d处死，取梗死侧额顶叶背外侧皮层制备脑单细胞悬液，免疫组织化学方法借助激光共聚焦与流式细胞仪检测缺血半暗带皮层神经元细胞内[ca2+]i、α-tubulin的荧光密度。 研究结果： 1.除正常组、假手术对照组外，其余各组动物于术后出现异常行为改变和神经功能障碍，尤以脑梗死组、经鼻NS组最为明显，二者之间的差异无统计学意义；皮下rhG-CSF组明显改善，经鼻rhG-CSF组较皮下组改善更加显著，差异具有统计学意义。 2.正常组、假手术组脑组织中FasL蛋白和HO-1阳性神经细胞见极少量表达；脑梗死组大鼠FasL蛋白和HO-1的阳性细胞数明显增加，1d组>3d组。表达区域主要为灶周皮质(paramedian cortex)和同侧海马：脑梗死组及脑梗死+经鼻生理盐水组FasL和HO-1的阳性细胞计数差异无统计学意义。rhG-CSF治疗后FasL，蛋白表达下降，而HO-1表达上调；在同一时间点，经鼻rhG-CSF组FasL蛋白表达低于皮下注射rhG-CSF组，而HO-1表达前组高于后组。 3.正常组及假手术组大鼠脑内存在少量BrdU阳性细胞。经鼻给予rhG-CSF组大鼠脑内BrdU阳性细胞数明显增加，鼻腔给予rhG-CSF组>皮下给予rhG-CSF组>脑梗死组。在SVZ和SGZ区域，7d组高于14d组；在缺血半暗带皮层，14d组高于7d组。除脉络丛外，经鼻给予rhG-CSF组大鼠脑内各部位均有BrdU+/GFAP+表达。各表达区域的BrdU+/GFAP+细胞数于再灌注后7d表达明显增高，鼻腔给予rhG-CSF组>皮下给予rhG-CSF组>脑梗死组，14d略有下降，降幅：鼻腔给予rhG-CSF组>皮下给予rhG-CSF组>脑梗死组。经鼻给予rhG-CSF后脑梗死大鼠脑内BrdU+/NeuN+和BrdU+/PSA-NCAM+细胞数也明显增加。在各时间段及各表达部位，不同分组之间BrdU+/NeuN+和BrdU+/PSA-NCAM+的表达顺序：鼻腔给予rhG-CSF组>皮下给予rhG-CSF组>脑梗死组。 4.假手术对照组与正常组比较，细胞内[Ca2+]i、α-tubulin无变化；脑梗死后神经元细胞内[Ca2+]i明显升高，升高幅度：脑梗死组>皮下注射rhG-CSF组>经鼻rhG-CSF组：α-tubulin表达降低，降低幅度经鼻生理盐水组>皮下注射rhG-CSF组>经鼻rhG-CSF组。 研究结论： 1.重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)能改善局灶性脑缺血大鼠的神经功能障碍，鼻腔给药比皮下给药疗效更显著。 2.经鼻应用rhG-CSF可以使凋亡蛋白配体FasL表达下降，HO-1表达上调，从而发挥对缺血性脑组织的保护作用。 3.rhG-CSF经鼻靶向中枢给药可以促进脑梗死后大鼠内源性神经干细胞的增殖和分化，增强其可塑性。 4.经鼻导入rhG-CSF可以比皮下给药更明显地抑制脑梗死大鼠缺血半暗带神经元胞内[ca2+]i的升高，减少α-微管蛋白(α-tubulin)的缺失。

目录

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前言

第一部分经鼻靶向中枢导入rhG-CSF对脑梗死大鼠行为及神经功能的影响

第二部分经鼻靶向中枢导入rhG-CSF对脑梗死大鼠的保护机制

实验一经鼻靶向中枢导入rhG-CSF对脑梗死大鼠FasL和HO-1表达的影响

实验二rhG-CSF鼻腔给药对脑梗死大鼠内源性神经干细胞增殖分化和可塑性的调节作用

实验三经鼻导入rhG-CSF对脑梗死大鼠缺血半暗带皮层神经元细胞内钙及α-tubulin的影响

小结

综述 多肽和蛋白质类药物经鼻靶向中枢给药的研究进展

致谢