大鼠SAH脑淋巴引流途径后神经干细胞增殖、分化及可塑性和银杏内酯与银杏黄酮的影响

摘要

研究背景： 近年来，在脑动脉瘤闭塞等手术开展逐渐增多和进步的情况下，蛛网膜下腔出血(SAH)病人再次出血的发生率已经大幅度下降，然而其病死率仍高达25％，存活下来的病人亦常由于继发性脑缺血的发生而遗留程度不等的永久性神经功能伤残。近年来研究表明，脑淋巴引流途径在维持脑组织内环境稳定中具有不可忽视的作用；脑内大分子物质经淋巴途径主要引流至颈部淋巴结。已经发现SAH可导致脑内大分子物质的淋巴引流途径相对功能不足：脑淋巴引流阻断可加重SAH后继发性脑缺血损伤。20世纪90年代以来，神经干细胞相继从哺乳动物及人的中枢神经系统分离培养成功后，“中枢神经系统损伤后不可再生”的传统观念被打破。神经干细胞能够分化成为神经元并具有修复脑组织结构的功能。首次发现了银杏叶提取物(EGb)能够改善SAH后脑血流并对SAH所致脑损伤具有保护作用。银杏内酯(Ginkgolides)和银含黄酮(Ginkgo flavones)是EGb的主要的药效组分，银含内酯是天然的、特异性的PAF受体拮抗剂，而PAF可通过促进血栓形成、降低腩血流量、增加脑耗氧量、加重脑水肿、影响神经细胞功能等参与脑缺血损伤的发生发展过程。银杏黄酮具有自由基清除特性，大量的研究证实自由基连锁反应在脑缺血损伤中起到重要作用。前期研究证明吡多醇(PN)可以在一定程度上改善SAH后脑内大分子物质经淋巴途径的引流，此研究进一步探讨银杏内酯和银杏黄酮对脑淋巴阻断后脑内神经干细胞增殖、分化及可塑性的影响。 研究目的： (1)探讨脑淋巴引流途径对大鼠SAH后脑水肿的影响及银杏内酯和银杏黄酮的作用。 (2)探讨脑淋巴引流途径对大鼠SAH后神经元和血管内应超微结构的影响及银杏内酯和银杏黄酮的保护作用。 (3)探讨脑淋巴引流途径对大鼠SAH后神经干细胞增殖、分化和可塑性的影响，观察银杏内酯和银含黄酮的干预作用。 研究方法： 1.实验选用健康成年雄性Wistar大鼠，采用枕大池内新鲜自体动脉血二次注入法建立SAH模型，用颈淋巴管结扎和颈淋巴结摘除法制作大鼠脑淋巴引流阻滞(CLB)模型。将动物分为：正常对照(control)组；蛛网膜下腔出血(SAH)组：SAH+脑淋巴阻断(CLB)组；SAH+CLB+生理盐水(NS)组；SAH+CLB+吡多醇(PN)；SAH+CLB+20mg/kg 银杏内酯组(Gl20组)；SAH+CLB+80mg/kg银杏内酯组(Gl80组)；SAH+CLB+50mg/kg银含黄酮组(Gf50组)；SAH+CLB+200mg/kg银杏黄酮组(Gf200组)。将各组动物分别于第二次注血后24小时和72小时快速断头处死，取脑，分离出皮层和海马组织，用干-湿重比较法计算脑组织含水率。 2.将上述各组动物于第二次注血后72h，麻醉，灌注并断头，取出双侧海马，制作常规透射电镜标本，观察海马神经元和血管内皮细胞的超微结构。 3.将上述各组动物分别于诱导SAH后3d、14d处死(对照组直接处死)，处死前1天腹腔注射BrdU。取出脑组织，冰冻切片。采用荧光免疫组织化学法检测，激光共聚焦显微镜观察神经干细胞在脑内(皮层、海马、室管膜下区等)的增殖情况，神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经转录因子Neurod和多唾液酸神经粘附因子PSA-NCAM的表达。显微镜下计数，用计算机图像分析系统进行分析。 研究结果： 1.诱导SAH后24h、72h，脑组织含水率SAH组显著高于非SAH组；在SAH+CLB组，腩组织含水率分别较SAH组又有所增加。各药物干预组与CLB+SAH组比较脑组织含水率明显降低；CLB+SAH+NS组与CLB+SAH组比较无明显差异；CLB+SAH+G120组高于CLB+SAH+PN组；CLB+SAH+G180组和CLB+SAH+Gf组均高于CLB+SAH+PN组；24小时和72小时后CLB+SAH+G120组高于CLB+SAH+G180组；银杏黄酮组两剂量组之间无明显差异；银杏内酯组与银含黄酮组比较无明显差异。 2.模型制作后72小时，电镜下可见SAH组神经元出现内质网水肿，线粒体轻微破坏，血管内皮细胞周边水肿。SAH+CLB组与SAH+CLB+NS组神经元损伤更加明显，核膜不完整，水肿变宽；线粒体肿胀破坏；内质网空泡化；高尔基体肿胀；血管内皮细胞明显水肿。CLB+SAH+PN组核膜稍有断续，不完整，内质网、高尔基体无明显变化。血管内皮轻度水肿。CLB+SAH+Gl80诱导组神经元结构较好，线粒体、核膜、高尔基体均变化不大，只见内质网轻度水肿，结构好于CLB+SAH+PN组。CLB+SAH+Gl20组神经元结构不如CLB+SAH+Gl80组，表现为核膜相对完好，只有小部分稍不完整，内质网轻微水肿，细胞间隙轻微变大。CLB+SAH+Gf200组神经元形态结构仪见轻微改变，稍有水肿，胞质中细胞器未见明显异常。CLB+SAH+Gf200组细胞结构不及CLB+SAH+Gf200组。 3.Brdu+增殖细胞：SAH组较多于正常对照组，CLB+SAH组又多于SAH组，而CLB+SAH+药物干预各组均多于非药物干预组，其中银杏内酯和银杏黄酮的高剂量组多于吡哆醇组。Neurod+/BrdU+细胞数，SAH组要多于正常对照组，但CLB+SAH组较SAH组阳性细胞数少，CLB+SAH+药物干预后阳性细胞较CLB+SAH+NS组有所增加，CLB+SAH+Gl与CLB+SAH+Gf组高于CLB+SAH+PN组，高剂量组阳性细胞数高于低剂量组，以CLB+SAH+Gl80组阳性细胞数增多最为明显。GFAP+/BrdU+阳性细胞：SAH组较正常对照组增多，CLB+SAH组明显多于SAH组，且CLB+SAH组阳性细胞数最多，药物干预后其阳性细胞个数均有所减少，CLB+SAH+PN组的阳性细胞数与CLB+SAH+NS组比较相对减少，CLB+SAH+Gl与CLB+SAH+Gf组均比CLB+SAH+PN组的阳性细胞数量少。PSA-NCAM+/BrdU+阳性细胞：在诱导SAH 14天后，PSA-NCAM+/BrdU+双阳性细胞所占BrdU+细胞的比例，SAH组高于正常对照组，CLB+SAH组较SAH组有所减少，CLB+SAH+药物干预后双阳性细胞所占比例较CLB+SAH+NS组有所增加，CLB+SAH+Gl与CLB+SAH+Gf组高于CLB+SAH+PN组，高剂量组双阳性细胞数高于低剂量组，以CLB+SAH+Gl80组阳性细胞数增多最为明显。 研究结论： 1.脑淋巴引流途径阻滞加重大鼠SAH后脑水肿，吡哆醇对之具有改善作用，银杏内酯和银杏黄酮可以减轻脑淋巴引流途径阻断后大鼠SAH后腩组织的水肿。 2.脑淋巴引流途径阻滞加重海马神经元超微结构及血管内皮的损伤，而银杏内酯和银杏黄酮对海马神经元和血管内皮细胞有保护作用。其中银含内酯对神经元的细胞核膜及线粒体保护作用相对较好，对内质网的保护作用稍差。银杏黄酮对神经元的核膜、内质网、高尔基体保护较好，对线粒体的保护作用不及银杏内酯。 3.脑淋巴引流途径阻滞后对大鼠SAH后脑内神经干细胞的增殖有促进作用，但不利于神经干细胞向神经元方向的分化；银杏内酯和银杏黄酮对脑淋巴引流途径阻断后大鼠SAH后的神经干细胞增殖有促进作用，并能促进神经干细胞向神经元方向分化。

目录

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前言

第一部分 大鼠SAH脑淋巴引流阻滞后脑组织含水率及超微结构变化及银含内酯和银杏黄酮的影响

第二部分大鼠SAH脑淋巴引流途径后神经干细胞增殖、分化及可塑性和银杏内酯与银杏黄酮的影响

综述一神经干细胞在脑卒中神经修复中的作用

综述二大鼠蛛网膜下腔出血模型的几种建立方法

致谢