荧光素脂质体的制备及其与病原菌的响应性研究

摘要

由细菌感染引发的并发症正在逐渐威胁人类的生命。传统的细菌检测方法耗时较长（24h-48h），新近发展起来的分子检测技术虽然提高了准确性，但是由于仪器昂贵，操作难度大也无法得到广泛的应用。所以，开发准确而又简单快速的细菌检测方法是有必要的。 纳米技术的研究和发展给这种思路提供了可能。目前主要可用于细菌比色检测的纳米颗粒主要包括：金属纳米粒子，量子点，脂质体等。其中，脂质体由于其无毒性、生物相容性好、生物降解性好、可以包封多种亲油性或者亲水性荧光染料并且同时能够靶向释放而最有希望应用在临床医疗中。本文通过薄膜分散-超声法制备了包封有5（6）-羧基荧光素的脂质体，以荧光泄漏量为指标，探究了膜材料中不同添加剂的用量对于脂质体稳定性的影响。并对它们作为传感器在与病原菌的响应上做出了研究。具体工作如下： （1）建立了5（6）-羧基荧光素的体外分析方法，其结果均符合方法学要求。通过荧光分光光度计建立了5（6）-羧基荧光素的标准曲线y=9.2419x+46.1014，相关系数 r2为0.997，表明其在0.1mmol/L~1mmol/L之间线性关系良好，满足实验要求。还确定了脂质体中磷脂含量的测定方法，通过紫外分光光度计建立了标准曲线为y=0.0826x-0.0762，相关系数为0.9994。表明磷脂在0-0.1mg/ml之间线性关系良好。 （2）采用薄膜分散-超声法制备了包封有5（6）-羧基荧光素的脂质体。考察了胆固醇(Cholesterol，CH)含量、十八胺(Octadecylamine，ODA)含量、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol)，DPPG)含量和10,12-二十五二炔酸（10,12-tricosadiyonic acid，TCDA）含量对于脂质体稳定性的影响。采用单因素设计的方法对处方进行了优化，获得较优处方。研究结果表明，在膜材料中掺入一定量的胆固醇、DPPG、TCDA可以增加脂质体的稳定性，而掺入十八胺却会降低脂质体的稳定性。另外，以大豆卵磷脂为主要膜材料的脂质体的稳定性普遍低于以DPPC为膜材料的脂质体的稳定性。同时，对较优处方的脂质体的理化性质研究表明，脂质体粒径均匀，在电镜下脂质体为多室脂质体，形态圆整，有比较明显的指纹状膜，并且与粒径测试结果较符合。在此基础上，探究了脂质体在不同pH（pH=5.4、pH=6.4、 pH=7.4）和不同温度（4℃、25℃、37℃）下的稳定性，筛选出了最佳处方为磷脂：胆固醇：TCDA=55:20:25，对最优处方的脂质体进行重复试验，其稳定性符合实验要求。还探讨了脂质体的紫外交联时间，在交联时间达到60s后，脂质体的颜色不再加深，最终选取60s为合适的紫外交联时间。 （3）通过选取三种伤口感染的典型细菌，分别是金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC25923），铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa PA01）和大肠杆菌（Escherichia coli DH5α）为主要的实验对象，确定了三种细菌的生长曲线。并且通过滴板计数法测得当OD600=0.1时三种细菌对应的菌种密度值。通过哥伦比亚血琼脂板培养实验验证了金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的毒性，得出金黄色葡萄球菌能够形成清晰的β溶血环，铜绿假单胞菌能够形成草绿色α溶血环，而大肠杆菌没有形成溶血环。通过控制变量法设计了三种类型的脂质体，与不同的细菌共孵育后得出了以下结论：（1）仅含有磷脂和胆固醇的脂质体，随着胆固醇量的增加，荧光素脂质体对于病原菌的响应逐渐减小；（2）控制胆固醇的量为20%，随着 TCDA量的增加，荧光素脂质体对于金黄色葡萄球菌的响应逐渐增加，而对于铜绿假单胞菌的响应却变化不大；（3）控制 TCDA的含量为25%，随着胆固醇量的增加，荧光素脂质体对于铜绿假单胞菌的响应逐渐增加，而对于金黄色葡萄球菌的响应却变化不大。所有类型的脂质体对于大肠杆菌（阴性对照）都没有明显的响应。确定了对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌均有较大响应的脂质体配方为磷脂：胆固醇：TCDA=55:20:25。通过将荧光素脂质体与一定浓度的菌液孵育20h，对荧光值进行连续测定后发现脂质体在细菌生长的对数期初期开始裂解。

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