TAT-HOXB4蛋白对恒河猴外周血造血干细胞动员效果的研究

摘要

目的：探讨TAT-HOXB4蛋白对恒河猴外周血造血干细胞动员(PBHSC)效果及评价该蛋白在短期内的安全性。
　　 内容：本实验包括四部分内容，首先是检测TAT-HOXB4蛋白进入细胞的能力，为实验可行性提供有力支持。第二部分是检测TAT-HOXB4蛋白对脐血CD34阳性细胞的体外扩增能力，为后续体内实验做铺垫。第三部分是检测TAT-HOXB4蛋白对恒河猴外周血造血干细胞(PBHSC)动员效果并评价最佳给药方式。第四部分是评价TAT-HOXB4蛋白安全性。
　　 方法：首先，利用WESTERN BLOTTING法和融合蛋白GFP法对公司提供的TAT-HOXB4蛋白进行检测，观察其是否具有进入细胞的能力。该蛋白只有进入细胞核内，才能有效发挥其生物学效应。其次，用MiniMACS分离人脐带血获得CD34阳性细胞，分别与未加入TAT-HOXB4蛋白的干细胞培养体系与加入TAT-HOXB4蛋白(将其作为作为扩增因子)的干细胞培养体系共培养，检测TAT-HOXB4蛋白体外扩增人CD34阳性细胞的能力。最后，将恒河猴分为四组，分别将G-CSF、G-CSF+TAT-HOXB4、TAT-HOXB4和生理盐水按一定剂量及相应给药方法对恒河猴行外周血造血干细胞动员。检测给药前和给药后的流式细胞分析(FCS)、血常规及肝肾功能，分析评价其动员效果、最优给药方法及短期内该蛋白的安全性。
　　 结果：TAT-HOXB4蛋白能够非常有效进入真核细胞的细胞核内，并能发挥其生物效应。先用GFP标记TAT-HOXB4蛋白，然后用DAPI对细胞核进行染色，经共同培养后发现GFP标记的HOXB4蛋白进入到细胞核中；以WESTERNBLOTTING法检测与TAT-HOXB4蛋白共培养后的细胞，可以在细胞核抽取部分检测到TAT-HOXB4蛋白条带存在，而未与TAT-HOXB4蛋白共同培养的细胞则未见此条带。由上述两实验可证实TAT-HOXB4具有良好的进入细胞内的能力。利用先前实验室已经得到TAT-HOXB4蛋白扩增细胞的最佳浓度及最佳处理条件扩增CD34阳性细胞。实验结果为：实验组CD34阳性细胞数为对照组的14倍，MNC为对照组的6倍，由此我们可以证明。TAT-HOXB4蛋白可在体外有效扩增CD34阳性细胞。经四种给药方式对恒河猴进行外周血造血干细胞动员，实验结果为：TAT-HOXB4组CD34+阳性细胞数占外周血单个核细胞数的百分比(CD34阳性细胞率)显著高于其它三组，TAT-HOXB4组的CD34阳性细胞率是G-CSF组的2.21倍，是G-CSF+TAT-HOXB4组的1.63倍。在动员期间及动员后，恒河猴均未出现明显的全身及局部不良反应，肝肾功能指标均在正常值范围内，而且在给药前后无明显变化。由此以上实验结果充分证明：TAT-HOXB4蛋白对恒河猴PBHSC的动员效果非常明显，且显著优于其它三个动员组，最佳给药方法为TAT-HOXB4组(动员第四天注射G-CSF)。同时我们发现TAT-HOXB4蛋白在短期内具有良好的安全性。
　　 结论：TAT-HOXB4蛋白能够有效进入细胞核内，并发挥其生物活性；TAT-HOXB4蛋白具有良好的体外扩增脐血CD34阳性细胞的活性TAT-HOXB4对恒河猴PBHSC动员效果显著，且在短期内，该蛋白具有良好的安全性。