应用非标记定量蛋白质组学技术筛选胃癌差异表达蛋白

摘要

目的:
　　 应用激光捕获显微切割(laser capture microdissection,LCM)联合基于液相色谱串联质谱的非标记定量蛋白质组学技术,对胃低分化腺癌组织及配对正常胃粘膜组织进行蛋白定量研究。筛选并鉴定两组样品蛋白质酶解产物之间的差异表达蛋白,为今后胃癌的发病机制及早期诊断、预后判断提供理论依据。
　　 方法:
　　 1.收集泰山医学院附属医院手术切除后的六对胃腺癌及配对正常胃组织(距癌组织至少5cm以外),术后经病理诊断均为低分化腺癌。用激光捕获显微切割(LCM)仪获取纯化的目的细胞,提取蛋白后将两组样本分别混合。采用纳升级二维液相色谱串联质谱(Nano2DLC-MS/MS)的非标记定量蛋白质组学技术筛选胃癌差异表达蛋白。应用生物信息学方法(GO和KEGG)对显著差异表达蛋白进行分析。
　　 2.从筛选的胃癌差异蛋白中挑选4个感兴趣的蛋白(Integrinα5、β-catcnin、AnnexinA2、Stat3),采用蛋白免疫印迹(Westernblot)和免疫组织化学方法对蛋白质组学结果进行验证。
　　 结果:
　　 1.应用LCM技术成功分离纯化胃癌及配对正常胃粘膜细胞。
　　 2.应用非标记定量技术在胃癌组织和正常胃粘膜组织中分别鉴定出1114和1155个蛋白质,75个为胃癌组织特有、116个为胃正常组织特有。在胃癌和配对正常组织共有的1039个蛋白质中差异倍数超过2倍的有264个,即137个上调蛋白和127个下调蛋白。采用GO富集分析和KEGG细胞信号通路注释发现,264个显著差异蛋白在细胞外成分(intracellular part)中具有较高富集,找到与细胞代谢等相关的分类,同时涉及多项分子功能,包括蛋白结合、核苷酸结合、细胞骨架构建等。KEGG结果显示这些蛋白参与24种信号转导通路,其中匹配率最高的是氧化磷酸化通路。
　　 3.Westernblot和免疫组织化学方法验证差异蛋白(Integrinα5、β-catenin、AnnexinA2、Stat3)表达的动态变化。Westernblot结果显示:Integrinα5、AnnexinA2和Stat3在胃癌组织中表达上调,β-catenin在胃癌组织中表达下调;免疫组织化学结果显示:与胃正常组织相比,Integrinα5和AnnexinA2在胃癌组织中表达上调,β-catenin在胃癌组织中表达下调。验证结果与蛋白质组学结果基本一致。
　　 结论:
　　 1.首次联合LCM与非标记定量蛋白质组学技术分析胃癌相关差异蛋白,鉴定出差异超过2倍上调蛋白137个、下调蛋白127个,癌组织特有蛋白75个,正常组织特有蛋白为116个。结果表明该方法可以成为研究胃癌差异蛋白质组学的有效手段。
　　 2.应用生物信息学方法分析质谱鉴定到的胃癌相关差异蛋白,这些蛋白涉及19种分子功能,如蛋白结合、细胞骨架构建、酶抑制活性等;参与24个生物过程,如细胞代谢、蛋白转运、应激反应等;细胞成分包括细胞内、细胞器、细胞外基质等21种,其中80％属于细胞内成分;共参与氧化磷酸化、细胞外机制受体相互作用、局灶黏附等24个信号转导通路,这些结果可为今后胃癌致癌机制及肿瘤标志物的研究奠定基础。
　　 3.Integrinα5、AnnexinA2、Stat3和β-catenin在6例胃低分化腺癌和配对正常胃粘膜组织中的Western blot和免疫组织化学结果与非标记定量蛋白组学结果基本一致。