汉族人常染色体显性遗传性多囊肾病1型致病基因突变检测体系的建立及应用

摘要

该研究包括三部分内容：1.PKD1全基因编码区的特异性扩增：利用PKD1与同源序列间细微的碱基差异，设计了82对涵盖PKD1编码区14.15kb的扩增引物，在对富集G、C碱基和重复序列的多拷贝区扩增时，首先利用长链PCR方法获得平均长度约3.7kb左右的8条扩增片段，成功排除了同源序列的干扰.接着通过57对巢式PCR引物，进一步将长链扩增产物分割成平均长度约285np左右的短片段，以便于下一步利用单链构象多态性分析技术来检测突变.2.单链构象多态性（single-strand confirmation polymorphism,SSCP）检测PKD1突变体系的建立：以85名正常人PKD1扩增产物为材料，通过调试SSCP电泳时所采用的非变性聚丙烯酰胺胶的不同厚度、不同凝胶配制方案及电场电压、电泳温度等参数，尤其是改进了传统上样缓冲液的配方，用蔗糖替代甲酰胺，显著增加了SSCP中单链浓度，提高了检测灵敏度.摸索出较为适合PKD1检测的工作条件，建立了筛检汉族人PKD1突变的PCR-SSCP检测体系.该技术体系已申报国家发明专利（申请号03115435.2）.3.ADPKD汉族人患者PKD1突变检测：利用建立的汉PKD1突变的PCR-SSCP检测体系，对19个ADPKD汉族人家系的67位成员PKD1进行了突变检测，结果发现了9个正常基因多态性位点、11个致病突变，后者包括了7个错义突变、2个无义突变、1个插入突变及1个缺失突变，其中有7个基因多态性位点和10个致病突变位点为首次报道.对突变结果的整理分析后发现：（1）除了上述新发现的基因多态性位点及致病突变位点外，已报道的多态性位点和致病突变位点的发生率与国外资料相比有明显不同，推测可能与不同人种间基因组碱基差异有关;（2）正常基因多态性和致病突变以碱基转换为主，即G与A之间或C与T之间的转换分别占50％和35％;（3）突变发生部位多集中在碱基重复序列区附近;（4）与正常基因多态性不同，致病突变常常导致其编码氨基酸亲水性和所带电荷的明显改变，从而推测氨基酸构成多态链的正确构象对维持多囊蛋白的正常生理功能具有重要作用;（5）虽然PKD1基因型与ADPKD患者的某种临床表现型间有特定的联系，但该研究发现某种突变的基因型与患者的起病症状间有密切关系，即同一ADPKD家系中，患者起病症状十分相近.该研究建立了以PCR-SSCP分析方法检测PKD1全基因编码区突变的筛查体系.首次报道了汉族人PKD1全编码区内的7个基因多态性位点和10个致病突变.这为探讨ADPKD基因型与表现型关系，阐明其发病机制奠定了基础，为实现多囊肾病的产前诊断和囊肿前诊断提供了有用的方法，使早期防治多囊肾病成为可能.

目录

前言

第一部分多囊肾病1型致病基因各外显子区域的特异性扩增

（一）实验材料

（二）实验方法

（三）实验结果

（四）讨论

（五）结论

第二部分单链构象多态性突变筛检体系的建立

（一）实验材料

（二）实验方法

（三）实验结果

（四）讨论

（五）结论

第三部分汉族人ADPKD患者PKD1突变位点的检测

（一）实验材料

（二）实验方法

（三）实验结果

（四）讨论

（五）结论

常染色体显性遗传性多囊肾病1型致病基因突变检测的研究进展

（一）PKD1结构的复杂性

（二）PKD1单拷贝区突变位点的检测

（三）PKD1 5’端多拷贝区突变位点的检测

（四）亚洲人群的PKD1突变检测进展

（五）PKD1突变分子机理

（六）PKD1基因型与表现型的关系

（七）目前ADPKD致病基因研究所面临的挑战及对策

（八）小结

多囊肾病1型致病基因突变检测中常用的技术方法

参考文献

附录一常用液体的配方

附录二有关本实验设计的引物序列相关资料

附录三常染色体显性遗传性多囊肾病1型致病基因各外显子序列及其相应的编码氨基酸产物

附录四鉴定出的PKD1基因正常变异及致病突变测序结果

附录五缩略词表

附录六博士期间已发表和已成文的论文及综述

致谢