庚型肝炎病毒生物学特性及其与丙型肝炎病毒的比较研究

摘要

该文亦在HGV体内外复制与表达、HGV致病性、HGV与HCV复制和表达差异及疫苗评价等方面进行了系列探讨.一、全长HGV转基因小鼠的遗传育种与特性研究:转基因小鼠是病毒的有效体系,利用该室克隆出的完整HGV cDNA克隆(HGV)构建由CMV启动子调控的含HGV全长基因的目的片段,用显微注射法建立了整合有HGV全长基因的Founder小鼠.该研究利用已建立的4株(<'＃>2、<'＃>4、<'＃>8、<'＃>9)Founder小鼠分别和同系正常异性小鼠交配的方式进行了转基因小鼠传代培育及建系.所产仔鼠经PCR和Southern blot进行筛选并以ELISA检测小鼠血清HGV抗原含量,免疫组织化学法检测小鼠组织HGV抗原表达.表达量较高的阳性小鼠被用于进一步传代、保种.目前,<'＃>2号Founder小鼠已传至F<,5>代并从中筛选出了表达量相对较高的小鼠品系,<'＃>8号Founder小鼠已传至F<,3>代,但<'＃>4、<'＃>9号Founder小鼠在传代过程中整合的外源基因丢失.对<'＃>2号Founder小鼠F<,1>-F<,5>代HGV NS3基因的分析表明,至少在有效的测序范围内,未发现核苷酸的突变或缺失.转基因小鼠各组织RT-PCR检测表明:HGV RNA可以在多个组织检测到,而且肝、肾、肺等若干组织还有复制中间体负链RNA的存在.二、鼠伤寒沙门氏菌pagC启动子的克隆与活性分析 从鼠伤寒沙门菌中克隆出pagC启动子(PpagC),构建体内激活的表达质粒pZW,插入庚型肝炎病毒(HGV)NS3基因,构建出表达质粒pZWNS3.以其转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,观察PpagC的启动活性.三、含体内激活启动子的重组减毒鼠伤寒沙门菌能诱导转基因鼠细胞免疫应答 该研究以庚型肝炎病毒(hepatitis G virus,HGV)转基因小鼠为模型,探讨逆转免疫耐受的方法及与HGV致病性的关系.四、HCV 1a/1b型嵌合体能在HepG2细胞内复制与表达 为研究丙型肝炎病毒(hepatitis G virus,HGV)1a和1b型嵌合体全长cDNA在HepG2细胞中的复制和表达.以HCV 1a/1b嵌合体cDNA构建表达质粒转染HepG2细胞,免疫组化和Western blotting检测HCV蛋白表达,RT-PCR检测HCV正、负链RNA.结果,转染细胞中检测到分子量约70KD的HCV NS3蛋白,转染细胞连续传20代,仍能检测到HCV正、负链RNA.证明该HCV嵌合体可以在细胞中复制和表达,HCV 1b型的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)可以起始含1a型非编码区的病毒复制.五、庚型肝炎病毒和丙型肝炎病毒的比较研究:全长cDNA克隆在体内外的表达与复制.HGV和HCV同属黄病毒科.二者有相似的基因结构.然而,HGV和HCV在致病性、嗜性、流行病学等方面确存在很大差异.研究HGV和HCV的复制和表达有助于理解二者生物学差异的机制.该课题的特色与创新之处:1、进行了转基因小鼠的遗传育种工作并筛选出能稳定传代和较高表达的HGV转基因小鼠品系,为在分子水平、细胞水平及整体水平研究HGV提供了一个很好的技术平台.2、将体内激活的pagC启动子(PpagC)应用于重组减毒伤寒沙门菌口服疫苗的构建.3、以HGV转基因小鼠为慢性带病毒的动物模型,探讨了逆转免疫耐受的方法.证明以体内激活的PpagC为转录调控元件的重组减毒伤寒沙门菌具潜在的免疫治疗作用,为慢性病毒性肝炎的治疗提供了一个新的思路.同时,打破T细胞耐受的转基因小鼠使HGV的研究更接近于自然感染.4、证明HCV嵌合体可以在细胞中复制和表达,HCV 1b型的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)可以起始含1a型非编码区的病毒复制,对阐明HCV复制和翻译机制有重要意义.5、HGV和HCV体外复制和表达及HGV体内、外复制和表达的差异研究有助于认识HGV和HCV生物学差异及病毒复制、蛋白剪切的分子机制.

目录

英文缩略词表

前 言

第一部分全长HGV转基因小鼠的遗传育种与特性研究

1主要材料

2. 方法

3 结果

4 讨论

第二部分鼠伤寒沙门氏菌pagC启动子的克隆与活性分析

1 材料和方法

2结果

3讨论

第三部分含体内激活启动子的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌能诱导转基因鼠细胞免疫应答

1材料和方法

2结果

3讨论

第四部分HCV1a/1b型嵌合体能在HepG2细胞内复制与表达

1材料和方法

2结果

3讨论

1材料和方法

2结果

3讨论

参考文献

总 结

综 述

致 谢

附 录