间充质干细胞与造血干细胞共移植促进造血重建的研究

摘要

骨髓中除含有生成各种血细胞的造血干细胞(hematopoietic stem cells;HSC)外,还存在着一类具有多向分化潜能的间充质干细胞(mesenchymal stem cells;MSC),MSC具有高度的自我更新能力,体外扩增能力极强,扩增后的MSC仍保持其正常表型和端粒酶活性;MSC具有多向分化潜能,在体内、外特定培养条件下可分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞、肝脏细胞和支持造血的基质细胞等;MSC分泌多种细胞因子,如造血和非造血生长因子、趋化因子等,调节骨髓微环境,促进自身及造血干细胞的增殖分化;MSC具有免疫调节能力,不表达主要组织相容复合体(major histocompatibility complex;MHC)Ⅱ类分子和T细胞共刺激分子B7,没有明显的免疫原性,并且抑制主要的和次要的混合淋巴细胞反应(Mixed lymphocyte reaction,MLR),具有免疫抑制性.大量研究表明MSC与HSC共移植可促进HSC归巢植入,增强造血;减轻移植物抗宿主病(graft versushost disease,GVHD);重建骨髓基质,维持造血.此外,MSC来源丰富,获取方便,研究中很少涉及伦理学和法律问题,因此是干细胞移植中最佳的细胞来源之一.虽然大量的实验研究已证实MSC可以促进自体或异体HSC移植后的造血重建和减轻GVHD,但目前MSC移植还处于起步阶段,尚有许多问题亟待解决.例如,最合适的MSC移植数量是多少?何时移植效果最佳?移植后植入率如何?植入后是否仍保留多向分化潜能?这些问题均有待进一步探讨.针对如上现状,本课题拟解决以下几个主要问题:(1)分离人骨髓MSC进行大规模培养扩增,研究培养扩增后的MSC的生物学特性并进行相关的安全性检测,建立MSC大规模培养扩增的技术平台.(2)应用细胞培养体系,观察MSC作为滋养层体外对人脐带血(umbilical cord blood,UCB)CD34<'+>细胞的支持作用,证实大规模培养扩增的MSC具有体外支持造血作用.(3)应用NOD/SCID鼠HSC移植模型,证实MSC对UCBCD34<'+>细胞植活的促进作用,明确MSC和HSC共移植的最适剂量和移植时机,提出临床实施方案.第一部分:人骨髓间充质干细胞体外大规模培养及其生物学特性研究;方法:抽取健康成人志愿者髂后上棘骨髓20ml,以密度为1.073g/ml的Percoll分离液分离骨髓单个核细胞(MNC),加入内含2mM L-谷氨酰胺的10﹪FBS/DMEM-LG培养液,以175cm<'2>的塑料培养皿进行大规模培养扩增;培养扩增的MSC常规液氮方法冻存6个月,复苏后,与持续体外培养的MSC进行相应代数(passage,P)的如下检测:显微镜下观察细胞形态特点;计数法绘制细胞生长曲线;FACS检测细胞周期和表面标志;成骨、成脂肪和成软骨鉴定其多向分化潜能;培养液进行细菌、真菌、支原体和衣原体的病原学检测;应用染色体R显带技术检测培养扩增的MSC细胞遗传学稳定性;裸鼠皮下注射MSC检测成瘤性.重复3次的实验结果,以SPSS统计软件之x<'2>检验、t检验和单因素方差分析进行统计学处理.结果:冻存复苏后与持续体外培养的MSC形态均为长梭形的成纤维细胞样;具有高度的增殖能力,在体外能大量扩增,20ml骨髓获得的MSC,传代培养至P3代,即可获得(4.41-5.04)×10<'8>的MSC;P1、P3、P7和P10代细胞周期检测显示贴壁细胞中的G0/G1占(89±0.86)﹪,S+G2+M期占(10.77±1.25)﹪;各代MSC不表达造血细胞表面标志,如CD34、CD45、CD14,也不表达与免疫排斥发生密切相关的CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD40、CD40L(CD154)和MHC-Ⅱ类抗原HLA-DR,MSC主要表达CD29、CD44、CD90、CD105、CD166和MHC-Ⅰ类抗原HLA-ABC,P3至P10代MSC细胞均一性可达到98﹪以上;在体外诱导培养下,MSC可分化为成骨、脂肪和软骨细胞,具有多向分化能力.结果表明大规模培养扩增的MSC不仅纯度高、生物学特性稳定,而且冻存复苏后的MSC与持续体外培养的MSC在所有生物学特性上无差异.P10代MSC染色体检测无异常改变、裸鼠背部皮下种植6个月未见肿瘤形成,各代细胞培养上清的细菌、真菌、支原体和衣原体检查均阴性,说明培养扩增的MSC可安全地用于体内.第二部分:人骨髓间充质干细胞体外支持造血作用;方法:<'60>Co γ射线照射贴壁培养的MSC和对照的成纤维细胞样人骨髓基质细胞系HFCL(Human bone marrowfibroblastoid stromal cell lineage,HFCL),照射剂量1500cGy,照射剂量率为20cGy/min,制备细胞滋养层.免疫磁珠法(magnetic cell sorting system,MACS)分离UCBCD34<'+>细胞.(1)根据滋养层细胞不同和是否添加细胞因子(50ng/ml rhFL、50ng/ml rhSCF、20ng/ml rhTPO)将实验分为六组:①Control组:无细胞因子和滋养层.②Cyto组:单纯细胞因子,无滋养层.③HFCL组:单纯HFCL滋养层.④MSC组:单纯MSC滋养层.⑤HFCL+Cyto组:HFCL滋养层加细胞因子.⑥MSC+Cyto组:MSC滋养层加细胞因子.接种UCBCD34<'+>细胞后培养12d,计数扩增后各组细胞总数;FACS检测CD34<'+>细胞百分比.(2)以MSC和/或HFCL为滋养层,应用LTC-IC专用培养基MyeloCult加1×10<'-6>M氢化可的松进行UCBCD34<'+>细胞体外长期培养(6~8W),每周半量换液的细胞取出后,进行CFU-GM集落培养,计数集落数.(3)统计学处理:重复3次实验结果以SPSS统计软件之t检验和单因素方差分析进行统计学处理.结果:(1)无论有否细胞因子存在,HFCL滋养层组扩增细胞总倍数明显高于MSC滋养层组(HFCL+Cyto组97.97±3.61 vs MSC+Cyto组70.61±4.18;HFCL组53.05±3.54 vs MSC组19.92±2.47,均P<0.01);HFCL滋养层组在细胞因子存在下,UCBCD34<'+>细胞扩增倍数明显高于MSC滋养层组(16.17±2.22 vs 9.39±2.12,P<0.01),无细胞因子存在时,两组间扩增倍数无显著差异(8.25±3.05 vs 8.2±1.91,P>0.05).结果表明,基质细胞系支持UCBCD34<'+>细胞的增殖能力优于MSC,协同细胞因子作用,增殖作用更加明显.(2)MSC滋养层组维持UCBCD34+细胞LTC-IC的能力明显优于HFCL滋养层组(P<0.05);细胞因子存在时,其作用更为明显(P<0.01).第三部分:人骨髓间充质干细胞与UCBCD34<'+>细胞共移植促进NOD/SCID小鼠造血重建;方法:1.应用稳定表达增强型绿色荧光蛋白的重组逆病毒(EGFP-RV)包装细胞系PG13/EGFP细胞培养上清转染男性MSC细胞.2.显微镜下观察MSC/EGFP细胞形态学改变、计数法绘制生长曲线、FACS检测表面抗原表达、成脂肪和成成骨细胞诱导分化鉴定多向分化潜能.3.体内实验分组:除正常对照组(5只小鼠)外,所有雌性NOD/SCID小鼠均给予350 cGy(剂量率:20cGy/min)的60Co γ射线照射,受照射NOD/SCID小鼠随机分组,每组5只小鼠,4~6h外侧尾静脉输注细胞.分组为:(1)Control组:无照射,与实验组同时输注0.2ml PBS.(2)Ir组:照射后4~6h内输注0.2ml PBS.(3)MSC组:照射后4~6h内输注MSC/EGFP细胞,输注量为1×10<'6>个/只.(4)HSC组:照射后4~6h内输注女性胎儿UCBCD34<'+>细胞,根据输注量不同分为4小组:①HSC<,1/1>组:UCBCD34<'+>细胞1×10<'6>个/只;②HSC<,1/5>组:UCBCD34<'+>细胞2×10<'5>个/只;③HSC<,1/1>0组UCBCD34<'+>细胞1×10<'5>个/只;④HSC<,1/15>组:UCBCD34<'+>细胞6.7×10<'4>个/只.(5)MSC+HSC组:1)MSC/EGFP输注量为1×10<'6>个/只,根据UCBCD34<'+>细胞输注量不同分为4小组:①MSC+HSC<,1/1>组:与下述M+H组为同一组;②M+H<,1/5>组:照射后4-6h内输注MSC/EGFP和2×10<'5>个UCBCD34<'+>细胞/只;③M+H<,1/10>组:照射后4-6h内输MSC/EGFP和1×10<'5>个UCBCD34<'+>细胞/只;④M+H<,1/15>组:照射后4-6h内输MSC/EGFP和6.7×10<'4>个UCBCD34<'+>细胞/只.2)两种细胞输注量各为1×10<'6>个/只,根据MSC/EGFP和UCBCD34<'+>细胞输注时间不同分为3小组:①M+H组:照射后4-6h内同时输注MSC/EGFP和UCBCD34<'+>细胞;②M+48H组:照射后4-6h内输注MSC/EGFP、48h后输UCBCD34<'+>细胞;③H+48M组:照射后4-6h内输UCBCD34<'+>细胞、48h后输MSC/EGFP.4.体内实验检测:(1)移植后第3d首次球后静脉取血20μ l,血细胞计数仪检测外周血血常规,此后1次/周,至42d.(2)移植后42d处死小鼠,FACS检测外周血、骨髓和脾脏人源细胞含量.(3)移植后42d处死小鼠:RT-PCR检测各脏器组织的人Y染色体特异片段DYS14;激光共聚焦显微镜检测组织冰冻切片中EGFP的表达;免疫组化鉴定MSC/EGFP细胞.5.统计学处理:各实验组均随机抽取3只小鼠,应用SPSS统计软件之t检验和单因素方差分析进行统计学处理.结论:(1)成功分离了人骨髓MSC,大规模培养扩增后的MSC仍保持其生物学特性,无成瘤性和病原体污染,可安全地用于体内,建立了MSC大规模培养扩增的技术平台.(2)大规模培养扩增的MSC作为滋养层体外对UCBCD34<'+>细胞具有造血支持作用,尤其具有维持LTC-IC的能力.(3)应用NOD/SCID小鼠HSC移植模型,证实了共移植MSC可全面促进造血,不存在系列限制性,并且低剂量的UCBCD34<'+>与相对高剂量的MSC同时移植效果最佳,可明显降低UCBCD34<'+>细胞的需要量.如上研究成果为MSC临床应用奠定了坚实基础.

目录

文摘

英文文摘

英文缩略语

前 言

第一部分：人骨髓间充质干细胞体外大规模培养及其生物学特性研究

材料和方法

第一部分结果

第一部分讨论

第二部分：人骨髓间充质干细胞体外支持造血作用

材料和方法

第二部分结果

第二部分讨论

第三部分：人骨髓间充质干细胞与造血干细胞共移植促进NOD/SCID鼠造血重建

材料和方法

第三部分结果

第三部分讨论

全文总结

综述 间充质干细胞：造血干细胞移植的新伴侣

参考文献

致 谢

博士期间发表的论文

承担的课题

获得的专利成果