抗氧化低密度脂蛋白抗体在动脉粥样硬化中的临床及实验研究

摘要

目的 关于动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)发病机理的研究，有越来越多的证据表明AS的发生、发展过程中，炎症反应担当着重要的作用，它贯穿疾病发生的始终。其中单核/巨噬细胞、T淋巴细胞及肥大细胞等炎症细胞也是人体主要的免疫细胞，因此免疫和炎症必然密不可分，免疫机制在AS中的相关研究业因此成为了AS研究中的新热点。研究表明自身免疫在AS的病理过程中发挥着极为重要的作用，包括热休克蛋白、C-反应蛋白及众多的修饰后脂蛋白都可以诱发自身抗体的生成。 氧化低密度脂蛋白(Oxidizedlowdensitylipoprotein，OX-LDL)最初因为其较低密度脂蛋白(Lowdensitylipoprotein，LDL)有更强的致泡沫细胞作用及细胞毒性，成为AS研究的热点。后继的研究发现，LDL在氧化过程中伴随着一系列的脂质及蛋白的分解和重新组合过程，产生了新的表位，具有类似异体蛋白的免疫源性，能够诱发自身抗体。已有的临床及实验研究发现抗OX-LDL抗体和AS的关系密切，但是其在AS中的具体机制仍然不清楚。 该研究从临床、动物实验及细胞研究三方面对抗氧化低密度脂蛋白抗体在AS发病过程中可能发挥的作用机制进行了探讨： 1.观察临床冠心病患者外周血抗OX-LDL水平与其临床表现的关系，探讨自身抗体在临床工作中的实践意义； 2.通过AS实验动物模型，观察斑块病变内免疫复合物的出现时间和局部分布特征，并给予辛伐他汀干预后观察其对免疫复合物影响。希望以此来进一步探讨免疫复合物与AS形成的关系及辛伐他汀可能存在的免疫调节作用； 3.通过体外细胞实验，观察抗OX-LDL抗体干预对OX-LDL与单核细胞相互作用的影响，探讨免疫复合物参与泡沫细胞形成的可能机制。 方法 1.以2002年12月—2003年6月住院治疗的冠心病患者共38例为观察对象，依据临床表现将其分为稳定性心绞痛(Stableanginapectoris，SAP)、不稳定性心绞痛(Unstableanginapectoris，UAP)、急性心肌梗死(Acutemyocardiuminfarction，AMI)3组，另有13例无冠心病及主要危险因子的患者作为对照组(Controlgroup，CON)，留取其血浆标本，以酶联免疫吸附测定方法(Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)测定外周血抗OX-LDL抗体(IgG)水平。利用冠状动脉造影技术(CoronaryAngiography，CAG)，对患者的冠脉狭窄程度进行半定量测定。其他资料，通过临床工作及常规生化检查获得。 2.将34只纯种新西兰大白兔分为对照组，高脂组，辛伐他汀预防组及辛伐他汀治疗组，分两阶段造模：半数的对照组、高脂组以及辛伐他汀预防组在8周；另一半的对照组、高脂组及辛伐他汀治疗组在第14周处死，取其主动脉标本，利用HE染色分析血管结构改变及斑块的生成发展情况。免疫组织化学技术分析AS斑块病变内免疫复合物的沉积及其类型以及辛伐他汀干预对免疫复合物形成的影响。 3.U937细胞和新西兰大白兔外周血单核细胞，经OX-LDL(人，10mg/L)及抗OX-LDL抗体(兔抗人，5mg/L)2个因素组合共分为对照组、OX-LDL刺激组、OX-LDL+抗OX-LDL抗体共孵育组及单纯抗OX-LDL抗体组4组，共培养24小时后，利用半定量RT-PCR技术分析CD36、CD40、MMP-9的mRNA表达量。 4.统计学处理：随机多组间均数比较用单向方差分析法，组间多重比较比较用SNK-q法，随机多组计数资料率及比值比较用卡方检验。资料间相关分析用线性相关，显著性用t检验，非正态分布资料用Spearman相关分析，显著性检验用非参数检验。检验p值统一为0.05。 结果 1.冠心病患者抗OX-LDL抗体水平显著高于对照组，其中又以ACS患者为显著，ACS患者外周血中的抗OX-LDL抗体又具有延迟效应，观察期内入院后7-10天的水平最高，各组之间的差异也最明显：AMI组(42.33±34.71)、UAP(47.45±20.56)、SAP组(34.61±40.88)。冠状动脉造影结果的半定量分析提示，冠心病患者各组之间无显著性差异：AMI组(1.0716±0.8957)、UAP组(1.0311±0.5971)、SAP组(0.9555±0.0133)、CON组(0.9158±0.0278)。抗OX-LDL抗体水平和血浆LDL浓度及冠脉狭窄程度之间没有显著相关性。在冠心病相关的各个因子中，体重指数(p=0.000)、平均吸烟量(p=0.007)、血压水平(p=0.000)、空腹血糖水平(p=0.04)及高密度脂蛋白(High-densitylipoprotein，HDL，p=0.08)在各组之间有显著性差异。 2.动物模型的主动脉在高脂喂养8周后即形成明显的AS斑块，高脂组的相对斑块面积是辛伐他汀预防组的约9.44倍。而到了第14周时高脂组的相对斑块面积进一步增加到8周时的2.93倍，是辛伐他汀治疗组的6.33倍，差异具有统计学意义。随着动脉粥样硬化的发展，IgG型免疫复合物在粥样斑块内的形成明显增多，而IgM型免疫复合物在斑块病变中的沉积不明显。同期的高脂组免疫组化染色强阳性率都显著高于辛伐他汀干预组。IgG型免疫复合物在早期斑块分布于内膜下，而在成熟斑块则主要分布于脂质核心和靠近内膜面肩部。 3.在加入抗OX-LDL抗体后可，OX-LDL刺激后的单核/巨噬细胞CD36、CD40、MMP9等因子的mRNA表达均有不同程度的减少，其中CD36和MMP9在U937细胞和在兔单核细胞分别平均降低了约64.80％和35.18％，细胞种属间差异有统计学意义。在U937细胞和在兔单核细胞分别平均降低了约47.21％和36.72％，种属间差异无统计学意义。 结论 1.抗OX-LDL抗体水平和动脉粥样硬化临床事件有正性关系，提示了自身免疫在动脉粥样硬化发生、发展过程中发挥重要作用。经过标准化测定的抗OX-LDL抗体可能成为评估AS危险的一个重要指标。抗OX-LDL抗体水平和冠脉狭窄程度及外周血LDL浓度缺乏相关性，其可能是AS一个相对独立的因子。在国人的AS患者中，HDL浓度的变化较LDL浓度的变化可能更有意义。 2.动脉粥样硬化斑块内存在着免疫复合物，以IgG型为主，其出现时间和分布情况均提示它和AS的形成和发展密切相关。IgM型免疫复合物在斑块内少量存在，其作用不甚清楚，可能和免疫调节有关。辛伐他汀可以在显著降低血脂和控制斑块发展的同时可以有效的减少斑块内免疫复合物的生成，可能和其具有的免疫调节作用有关。 3抗OX-LDL抗体在离体细胞实验中可以抑制单核细胞被OX-LDL激活，减少其炎症分泌，具有抗AS作用，提示自身免疫可能是机体针对AS的保护机制。抗OX-LDL抗体的抗AS机制可能包括抗体的封闭作用、降低巨噬细胞吞噬效率等，该作用具有种属特异性。 4.该研究从一个侧面说明了动脉粥样硬化和自身免疫密切相关，包括抗OX-LDL抗体在内的自身抗体在动脉粥样硬化中发挥重要作用，而并不仅仅是疾病的一个标志。

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前 言

冠心病患者血清抗OX-LDL抗体水平与临床表现的关系

材料和方法

结 果

讨 论

第二部分 分辛伐他汀对自身免疫复合物在斑块形成的影响

方法和材料

结 果

讨 论

抗 OX-LDL抗体对单核细胞炎症反应的影响

材料和方法

结 果

讨 论

参考文献

总 结

致 谢

综述 1 抗OX-LDL自身抗体与动脉粥样硬化的关系

综述2 他汀的免疫调节作用