应用基因芯片技术研究2型糖尿病胰岛素抵抗脂肪组织相关基因表达及其鉴定

摘要

2型糖尿病的发病率近年来在全球逐年增长，在发达国家糖尿病患病率已达3-7％，成为仅次于癌肿、艾滋病、心血管病之后第4位需要优先考虑的疾病，已成为世界第5位死亡主因，严重危害人民生活健康。2型糖尿病的发病机制目前尚不清楚，由于2型糖尿病的早期诊断至今并不理想，因此如何在分子水平探讨2型糖尿病发病机制并对其进行早期诊断及预防已成为这一领域中的研究热点。 胰岛素抵抗为2型糖尿病的基本病理生理改变，同时也是一些代谢疾病如冠心病、高血压、肥胖及血脂异常、动脉粥样硬化等发生的独立危险因素。尽管脂肪组织在外周葡萄糖利用中只占有很小的比例，但它却在胰岛素抵抗过程中发挥重要作用。胰岛素抵抗是遗传因素和环境因素共同作用的结果。但即使将目前所知的环境因素均考虑在内，也仅能解释不到三分之一的胰岛素抵抗成因。因此，遗传因素可能是胰岛素抵抗的主要原因。目前研究认为，2型糖尿病胰岛素抵抗的发生是多种相关基因表达失常或失活所致。已发现胰岛素抵抗的许多候选基因，如胰岛素受体底物1，糖原合成酶，UCP-3，GLUT4，己糖激酶Ⅱ，磷脂酰肌醇3-激酶，丝氨酸-苏氨酸激酶，Rad基因与钙调蛋白-10等。虽然已证实在2型糖尿病中确实存在这些物质的改变，但还不清楚哪些基因是胰岛素抵抗的主效基因、次效基因和微效基因。实验表明在2型糖尿病胰岛素抵抗产生的复杂过程中，很可能存在着这样相互协调的共表达的基因群体。因而将在脂肪组织中各个环节和阶段共同表达的众多基因作为一个“基因群”(genecluster)进行研究，筛选在2型糖尿病胰岛素抵抗过程中的多个环节上起作用的分子和起关键性调控作用的基因，发现脂肪组织与胰岛素抵抗的内在联系，揭示胰岛素抵抗的本质，将对于早期诊断2型糖尿病、有效地预防2型糖尿病及指导进一步治疗具有重要意义。 基因芯片也称为基因微矩阵(Microarray)，是近几年发展起来的一项前沿生物技术。它在一次实验中可以对上万种基因的表达水平进行快速、准确、高效的检测，从而达到高效率、高通量、低成本地筛查和分析差异表达基因的目的，为研究在2型糖尿病胰岛素抵抗过程中各个环节和阶段相互协调、共同表达的基因群提供了强有力的工具。 [研究目的] 应用基因芯片技术比较2型糖尿病胰岛素抵抗患者与正常人大网膜脂肪组织相关基因表达谱的差异，以进一步阐明胰岛素抵抗的发病机制并探索新的治疗方法。 [实验方法] 1、依照稳态模式评估法的胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)作为胰岛素抵抗(IR)的诊断标准，收集伴IR的2型糖尿病(实验组)及无IR血糖正常(对照组)配对大网膜标本各2例，均取自外科手术患者。 2、一步法抽提大网膜脂肪组织总RNA，纯化mRNA，将4096种人类基因PCR产物用Cartesian点样微矩阵列点样于化学涂层的载玻片上，制成基因芯片，并重复两次；分别以Cy5和Cy3两种荧光染料通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)将胰岛素抵抗组和对照组脂肪组织的mRNA标记成探针，并与基因表达谱芯片进行杂交。通过GenePix4000B扫描仪扫描芯片荧光信号图像，经计算机软件分析，寻找两组差异表达基因。 3、抽提大网膜脂肪组织总RNA，设计并合成双特异性有丝分裂原激活的蛋白激酶磷酸酶4(MKP-4)、磷脂酰肌醇4-磷酸盐5-激酶Ⅱ型β(PIP5K2B)、叉头框C2(FOXC2)引物，分别进行RT-PCR和Northernblot半定量分析其mRNA表达量，对基因芯片的结果进行验证。 [结果] 1、按差异显著阳性标准，通过2次基因芯片筛选，从4096个基因中筛选出在大网膜脂肪组织中与2型糖尿病胰岛素抵抗可能相关的共同差异表达的82条基因，其中42条基因表达上调(2.0倍以上)，40条基因表达下调(0.5倍以下)。差异表达基因涉及代谢，细胞信号转导，还包括原癌与抑癌基因、离子通道与运输蛋白基因、凋亡基因、免疫相关基因、蛋白翻译合成基因、细胞增殖与分化相关基因、细胞骨架组成基因等。 2、与2型糖尿病胰岛素抵抗明显相关的差异表达基因主要集中在信号转导通路及代谢方面。其中，与细胞信号转导相关的MKP-4及与脂肪细胞代谢相关的叉头框C2(FOXC2)表达明显增加，而PIP5K2B明显减少。 3、RT-PCR显示MKP-4在2型糖尿病胰岛素抵抗患者的大网膜脂肪组织中高表达，PIP5K2B是低表达。Northernblot半定量研究显示编码FOXC2的基因在2型糖尿病胰岛素抵抗大网膜脂肪组织中高表达。结果与基因表达谱芯片结果吻合。 [结论] 1、胰岛素抵抗是2型糖尿病的基本病理生理改变。应用基因芯片技术比较2型糖尿病伴胰岛素抵抗患者与无胰岛素抵抗正常对照的大网膜脂肪组织mRNA差异表达基因，实验结果证实脂肪组织与胰岛素抵抗机制密切相关，差异表达基因主要集中在信号转导通路及代谢方面。说明2型糖尿病胰岛素抵抗是多基因因素共同改变的结果，同时与胰岛素信号转导通路及代谢密切相关，应用用基因芯片技术对2型糖尿病胰岛素抵抗过程中的众多基因表达方式进行深入研究是可行的。 2、分别应用RT-PCR对MKP-4、PIP5K2B进行验证，应用Northernblot对FOXC2验证，结果与芯片扫描结果吻合，提示这3条基因的表达与胰岛素抵抗有关，为探索胰岛素抵抗分子机制提供了新的方向，也为2型糖尿病的防治提供新的靶点。

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中英文摘要

缩略语中、英文对照

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英文详细摘要

前言

第一部分2型糖尿病胰岛素抵抗脂肪组织差异表达基因的筛选与分析

引言

1材料与方法

2实验结果

3讨论

参考文献

第二部分2型糖尿病胰岛素抵抗脂肪组织信号转导相关差异表达基因的鉴定41

引言

1材料与方法

3讨论

参考文献

第三部分2型糖尿病胰岛素抵抗脂肪组织代谢相关差异表达基因的鉴定

引言

1材料与方法

2实验结果

3讨论

参考文献

结论

综述 基因芯片技术在胰岛素抵抗研究中的应用进展

致谢