E-选择素在长春瑞宾致输液性静脉炎中的作用机制及药物调控研究

摘要

药物输液性静脉炎是临床常见的药源性疾病之一，其发病率高、危害较大，给病人造成很多不必要的生理、心理痛苦和医疗支出，严重影响临床药物治疗的依从性和疗效。目前临床上此类不良反应发生较频繁，但缺乏针对性强、效果可靠的防治措施，因此急需寻找理论依据，建立规范方案和有效措施。 本研究首先在小鼠和家兔体内模拟了长春瑞宾导致输液性静脉炎的过程，利用两种动物考察了各种因素对其病理变化的影响；并应用病理评分方法初步考察西咪替丁的干预效果；应用免疫组化法在动物模型初步证实该类静脉炎发生过程与E-selectin表达存在相关性；继而采用免疫组化、ELISA法和流式细胞术分别定性和定量考察长春瑞宾、西咪替丁等各种药物对E-selectin表达的影响；采用细胞黏附实验法证实，在E-selectin蛋白表达的基础上，其促进细胞黏附的功能也发生了相应的变化；采用real-timePCR法证实上述过程中E-selectin蛋白表达与其mRNA表达一致，提示该过程受其基因调控；为探讨其信号转导途径，采用NF-κB通路活性测定ELISA法同时测定内皮细胞内活化、磷酸化及总体NF-κB量，初步提示长春瑞宾上调E-selectin并导致输液性静脉炎的过程具有NF-κB通路依赖性。 第一部分长春瑞宾致输液性静脉炎动物病理学研究及影响因素考察1.以新西兰兔及昆明种小鼠为实验研究动物，模拟临床药物治疗中长春瑞宾致输液性静脉炎的过程。在家兔耳缘静脉模型中，分别以内皮细胞脱落、炎性细胞浸润、血栓形成等病理学指标评价并优化实验条件，考察药物作用时间、病理取材部位、给药浓度、给药速度等因素对实验的影响。结果选择给药速度12mL/h，浓度10mg/mL，剂量5mg/kg，药物作用时间24h，病理取材部位2号位(针尖部进针方向1cm)等为实验条件。 以小鼠尾静脉模拟静脉推注致药物性静脉炎的临床过程，同样应用上述病理学指标进行综合评价。 2.分别在上述两种动物模拟实验中，采用内皮细胞损伤、炎性细胞浸润、血栓形成、水肿程度等病理学分级指标研究西咪替丁干预长春瑞宾输液性静脉炎的效果。结果经统计学分析证明，西咪替丁干预对输液性静脉炎各种病理学改变的发生率影响无统计学意义(P＞0.05)；但其对上述病理学改变的程度的减轻有统计学意义(P＜0.05)。证实该药具有缓解静脉炎症状的作用。 3.采用ELISA法考察家兔受长春瑞宾刺激后体内各种血清学指标的改变。包括黏附分子ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、P-selectin，纤溶平衡系统指标t-PA、PAI等指标，结果提示E-selectin在长春瑞宾刺激后有上升趋势，可由(0.920±0.522)ng/mL升高至(1.534±0.449)ng/mL(P＜0.05)；而西咪替丁可较明显地抑制该过程，使其表达自(1.715±0.354)ng/mL下调至(1.012±0.659)ng/mL(P＜0.05)；提示长春瑞宾致输液性静脉炎及西咪替丁的干预作用可能与其具有相关性。给药前后的t-PA水平仅在VIN组有统计学意义的差异(P＜0.01)，该水平下降了35.41％，提示家兔血液纤溶系统平衡受到VIN给药的影响，出现凝血机制加大的倾向。 第二部分E-selectin在长春瑞宾致输液性静脉炎过程中的表达及药物的调控作用1.采用免疫组化方法检测家兔模型、小鼠模型及内皮细胞ECV304中E-selectin的表达，结果表明：E-selectin在正常动物模型血管内皮及未活化的内皮细胞中表达量很低，长春瑞宾刺激后的动物血管内皮及体外内皮细胞均有明显棕黄色阳性表达。 2.采用ELISA法测定了ECV304细胞受不同剂量长春瑞宾、不同作用时间刺激后细胞培养液中可溶性E-selectin的含量。长春瑞宾可使其表达量自(930.939±103.040)pg/mL上调至(1278.467±62.197)pg/mL(P＜0.01)；西咪替丁可抑制上述E-selectin的表达，使其下调至(1070.267±103.040)pg/mL(P＜0.05)。而另一与内皮细胞和白细胞黏附作用相关的黏附分子sICAM-1变化缺乏相关性。 3.采用流式细胞术考察了ECV304细胞受长春瑞宾刺激后细胞膜上E-selectin的含量变化。进一步证实长春瑞宾具有上调血管内皮细胞胞膜E-selectin表达(P＜0.01)的作用，而西咪替丁和富马酸二甲酯则具有抑制其表达的作用。 4.采用ELISA法测定了9例临床肺癌患者应用长春瑞宾前后血清中可溶性E-selectin的水平，初步表明患者血清中的E-selectin水平在应用长春瑞宾后可明显上升，自(31.50±28.65)ng/mL升高至(43.08±44.49)ng/mL(P＜0.05)。提示E-selectin上升可能是该类药物输液性静脉炎发生的重要因素。 上述结果表明：E-selectin参与了长春瑞宾致输液性静脉炎的病理过程，西咪替丁对该过程可能存在抑制作用，对内皮细胞E-selectin的调控可能是其干预该类输液性静脉炎的作用机制之一。 第三部分长春瑞宾刺激对内皮细胞与中性粒细胞间黏附功能的影响及其与内皮细胞E-selectin表达的相关性 采用虎红染色比色法考察内皮细胞系ECV304在受长春瑞宾刺激后，与外部加入的中性粒细胞黏附作用的变化。结果表明，以长春瑞宾刺激后，内皮细胞与中性粒细胞共存体系染色后的OD值显著增加(P＜0.05)，计算细胞黏附率最高可提高4.3倍；镜下也观察到对黏附率影响的程度具有差别，该趋势与相同条件下内皮细胞E-selectin的表达量具有一定相关性，表明长春瑞宾可能通过上调内皮细胞E-selectin而增强其与粒细胞之间的黏附作用；西咪替丁和富马酸二甲酯等对此过程具有一定的抑制作用(P＜0.01)，分别对黏附率下调74.34％和84.65％。 以上发现表明，长春瑞宾可能通过上调内皮细胞E-selectin的表达而增强白细胞与其黏附作用，从而引起内皮损伤及白细胞穿越和浸润等炎性发展过程，进而向输液性静脉炎发展；而西咪替丁正是因为具有下调上述E-selectin的作用，从而发挥了抑制输液性静脉炎相关症状表现的作用，可望作为临床防治该类药物性静脉炎的防治药物。 第四部分长春瑞宾对内皮细胞E-selectin表达的基因调控研究 采用real-timePCR法测定长春瑞宾刺激内皮细胞E-selectinmRNA的表达。长春瑞宾刺激内皮细胞可引起E-selectinmRNA的表达，但较TNF-α刺激后水平略低；CIM可有效抑制VIN引起的E-selectinmRNA的表达(下调52.94％)，与其对TNF-α刺激后表达的抑制作用相当(下调52.47％)；DMF对VIN和TNF-α刺激后E-selectinmRNA表达的抑制作用都很强(分别下调68.10％和85.52％)。 上述结果提示，E-selectin在长春瑞宾致输液性静脉炎发生机制中具有重要的作用。由于药物刺激引起E-selectin基因在内皮细胞中表达，并使细胞膜上E-selectin蛋白迅速表达，进而促进内皮细胞与粒细胞等黏附增强，启动血管内皮损伤、炎性改变、血栓形成等一系列病理学过程，最终引起静脉炎的发生。 第五部分长春瑞宾上调内皮细胞E-selectin表达作用与NF-κB通路的相关性初步考察1.采用免疫组化法在动物及内皮细胞模型检测长春瑞宾刺激后，核转录因子NF-κB在内皮细胞的表达。证实长春瑞宾及TNF-α可引起NF-κBp65在内皮细胞的阳性表达，西咪替丁及DMF可减弱其表达。提示NF-κB通路可能是长春瑞宾导致E-selectin表达过程中信号转导的途径之一；西咪替丁可通过NF-κB通路抑制E-selectin表达。 2.采用NF-κB通路活性ELISA测定法，同时测定长春瑞宾刺激内皮细胞后NF-κBp65总量、活化的NF-κBp65及磷酸化的NF-κBp65量，研究各种药物对长春瑞宾引起E-selectin表达过程中，NF-κB通路活化状态和活化程度。结果提示，长春瑞宾刺激后，内皮细胞中NF-κBp65活化并发生Ser536位点磷酸化，其NF-κB发生核内移位，上述信号转导途径可能引起核内E-selectin基因表达，从而引起胞膜E-selectin表达；DMF和CIM均存在抑制NF-κB向核内易位的作用。 通过本课题的研究，在动物体内及人体内初步考察了长春瑞宾致输液性静脉炎的病理改变，并在体外利用内皮细胞系ECV304考察了E-selectin蛋白表达、黏附功能变化及其与E-selectinmRNA和NF-κB等变化的相关性，为考察药物输液性静脉炎及其影响因素和发生机制进行了初步研究；较系统地阐明了E-selectin在长春瑞宾致输液性静脉炎过程中的作用及调控机制，为长春碱类药物所致的输液性疾病的预防和治疗提供了可能的靶点；探讨了西咪替丁对该靶点作用的可行性和用药依据。本研究为该类药源性疾病的临床防治提供了针对性强、效果更确切的理论依据。

目录

论文说明：缩略词表

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前 言

第一部分长春瑞宾致输液性静脉炎动物病理学研究及影响因素考察

第二部分E-selectin在长春瑞宾致输液性静脉炎过程中的表达及药物的调控作用

第三部分长春瑞宾刺激对内皮细胞与中性粒细胞间黏附功能的影响及其与内皮细胞E-selectin表达的相关性

第四部分长春瑞宾对内皮细胞E-selectin表达的基因调控研究

第五部分长春瑞宾上调内皮细胞E-selectin表达作用与NF-κB通路的相关性初步考察

结 论

参考文献

致谢

综述1黏附分子表达在输液性静脉炎中的作用

综述2输液性静脉炎的研究现状

博士期间发表论文、参编论著、学术会议等情况