皮肤细胞色素P450酶的表达调控及相关药物代谢研究

摘要

皮肤是人体最大的器官，是机体和外界之间的天然屏障，可防止外界有害物质的入侵，也是药物经皮吸收的给药部位。皮肤表达有多种代谢酶，是肝外药物代谢的主要器官之一。细胞色素P450酶系(cytochromeP450，CYP)是一组含亚铁血红素的酶，参与了许多内源性物质如类固醇、脂肪酸、胆酸、维生素D3、前列腺素、儿茶芬胺和许多进入体内的外源性物质如药物、杀虫剂、毒物、致癌物的代谢。涉及药物代谢的CYP酶系主要有CYPl、CYP2和CYP3三个家族。各类CYP酶在维持皮肤的正常生理功能和保持内环境的稳定方面发挥着重要的作用。研究皮肤中的CYP酶的表达特点有助于明确药物的经皮吸收机理和药物在皮肤的代谢过程，从而对提高药物治疗效果、开发经皮给药新制剂、防止药物和毒性物质对皮肤的侵害等，具有重要意义。 近年来，皮肤CYP酶的研究已成为皮肤药理学的研究热点。一方面皮肤是过敏和炎症的频发部位，发病机制复杂，角质形成细胞和成纤维细胞等参与了皮肤过敏、炎症和免疫反应。探讨病理因素在皮肤CYP酶表达调节中的作用，为探索皮肤疾病的发病机制及临床治疗提供新靶点。另一方面，各种皮肤疾病的治疗离不开药物，而这些治疗药物又是多种CYP酶的底物，探讨皮肤CYP相关的药物代谢，有助于合理选择治疗药物，减少药物不良反应。 本研究首先建立了用于检测皮肤多种CYP酶表达的免疫组化和RealtimePCR方法，考察了角质形成细胞和健康人皮肤组织CYP的表达特点。采用OligoGEArray(R)毒理与药物耐受基因芯片检测银屑病患者皮损组织和经组胺刺激的HaCaT细胞CYPmRNA的表达改变，RealtimePCR法定量检测CYP酶在HaCaT细胞中的表达调控，考察了细胞因子TNFα，IL-2，IL-6，IFNγ对CYPmRNA表达的影响，研究了地塞米松和苯巴比妥对CYP的诱导作用。选择右美沙芬为CYP2D6的探针药物，采用LC/MS/MS方法检测代谢产物去甲基右美沙芬的转化量，研究其在大鼠皮肤匀浆中的代谢过程，并与肝匀浆代谢比较，来考察大鼠皮肤CYP2D6酶活性和特比萘芬对CYP2D6的抑制作用。 第一部分免疫组化法检测CYP在HaCaT细胞和健康人皮肤组织中的表达 采用免疫组化方法检测了涉及药物代谢的CYP1，2，3系列的5种CYP酶(CYP1A1，CYP1A2，CYP2C9/19，CYP2D6，CYP3A4)在HaCaT细胞和健康人皮肤组织中的表达，结果表明： 1.健康人皮肤组织均可见5种CYP酶的棕黄色阳性表达，但表达强度存在差异，以CYP2C9/19，CYP2D6和CYP3A4表达较强，CYP1A1次之，CYP1A2较弱。表达部位主要集中在表皮，以靠近皮肤外侧的角质层更为明显，皮脂腺、小汗腺和毛囊等皮肤附属器及淋巴细胞、单核细胞等也有多种CYP酶表达。 2.HaCaT细胞和肝L02细胞均可见棕黄色阳性表达，L02细胞较HaCaT细胞表达更显著。HaCaT细胞各种CYP酶的表达强度存在差异，以CYP1A1最强，其它均较弱；L02细胞各种CYP酶的表达强度差异不明显。 第二部分RealtimePCR法定量检测CYPmRNA在HaCaT细胞和健康人皮肤组织中的表达 建立了同一体系下定量检测CYP1A1，CYP1A2，CYP1B1，CYP2C9，CYPC19，CYP2E1，CYP2D6和CYP3A4八个CYP基因mRNA表达的RealtimePCR方法，并应用于健康人皮肤组织和HaCaT细胞的CYPmRNA检测，结果表明： 1.CYP1A1，CYP1A2，CYP1B1，CYP2C9，CYP2C19，CYP2E1，CYP2D6和CYP3A4均可在健康人皮肤组织中检测到，以CYP1A1，CYP1B1，CYP2C19，CYP2E1，CYP2D6表达水平较高，CYP1A2和CYP3A4表达水平较低。 2.包皮组织检测结果显示上述CYPmRNA表达具有较大的个体差异，其中CYP1A1个体差异最大，最低和最高表达量之间相差115.36倍。包皮组织与其它部位相应CYPmRNA表达相比，CYP2C9，CYP2C19，CYP2E1和CYP3A4存在显著性差异(P＜0.05)，CYP1A1和CYP2D6无显著性差异(P＞0.05)；头颈部皮肤组织与四肢躯体部位相比，仅CYP1A1mRNA表达存在显著性差异(P＜0.05)，CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19，CYP2E1，CYP2D6和CYP3A4mRNA均无显著性差异(P＞0.05)。 3.HaCaT细胞CYPmRNA表达水平总体与健康人皮肤组织一致，CYP1A2和CYP3A4表达较皮肤组织低。 第三部分银屑病患者皮损组织CYP的芯片检测 采用OligoGEArray(R)毒理与药物耐受基因芯片检测银屑病患者皮损组织CYP酶mRNA表达情况(共23种)，并与健康皮肤组织比较，CYP1A1，CYP1A2，CYP1B1，CYP3A5mRNA上调22.99％～32.76％;CYP24A1，CYP26B1，CYP2A6，CYP2C8，CYP2C9，CYP2D6，CYP2E1下调21.77％～45.08％。结果表明，CYP酶在银屑病患者皮损组织表达发生了改变，这种改变可能与银屑病的发病机制及局部皮损组织的免疫环境改变有关。与健康人基因表达相比，NOS上调了2.67倍，使NO水平显著高于正常，NO可能参与了CYP的表达调控。 第四部分组胺刺激HaCaT细胞后CYP的芯片检测 以组胺刺激HaCaT细胞，在体外模拟皮肤炎症状态，采用OligoGEArray(R)毒理与药物耐受基因芯片检测细胞CYPmRNA表达情况，通过与未处理对照细胞及H1受体拮抗剂西替利嗪干预进行比较，探讨了组胺在CYP酶表达调控中的作用，为探索过敏炎症发病机制及临床治疗提供新靶点。结果表明组胺仅上调CYP4B1表达(22.60％)，并可被西替利嗪逆转；组胺对CYP11A1，CYP11B2，CYP1A1，CYP1B1，CYP20A1，CYP26B1，CYP2B6，CYP2C8，CYP2C9，CYP2D6，CYP3A5，CYP4A11，CYP4F3下调20.91％～52.30％;盐酸西替利嗪是新型H1受体拮抗剂，临床广泛用于治疗各种过敏性疾病。西替利嗪对组胺引起的CYP改变，有不同程度的恢复作用，说明H1受体参与了对CYP的调节，但组胺引起的CYP下调不能完全被西替利嗪所逆转，说明组胺对CYPmRNA表达的影响不完全由H1受体介导，可能还存在着其它的调节机制。 第五部分CYP酶在人表皮角质形成细胞中的表达调控 采用RealtimePCR法定量检测CYP酶在HaCaT细胞中的表达调控，考察了细胞因子TNFα，IL-2，IL-6，IFNY对CYPmRNA表达的影响，研究了地塞米松和苯巴比妥对CYP的诱导作用。结果表明，TNFα，IL-6，IFNY对CYP2D6和CYP2E1的表达无明显影响(P＞0.05)。20和100ng/ml浓度的IL-2校正CT值为11.86±0.53和11.62±0.32，与对照细胞校正CT值为10.53±0.14相比均有显著性差异(P＜0.05)。20和100ng/ml的IL-2可分别使CYP2D6mRNA的表达下降到对照细胞的2.51和2.13倍。但IL一2对CYP1A1mRNA无明显影响(P＞0.05)。与肝CYP研究结果一致，地塞米松可诱导HaCaT细胞CYP3A4mRNA的表达，与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05)。2×10-6M，1×10-5M和5×10-5M浓度的地塞米松分别使CYP3A4mRNA的表达增加到11.16，10.63和18.63倍；5×10-4M的高浓度苯巴比妥可以诱导HaCaT细胞CYP2C9mRNA的表达，与对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。 第六部分皮肤右美沙芬经CYP2D6代谢与特比萘芬的抑制作用 采用右美沙芬为探针药物，将右美沙芬加入至皮肤匀浆中进行37C孵育，通过建立测定皮肤匀浆中右美沙芬代谢产物去甲基右美沙芬浓度的高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)。通过测定去甲基右美沙芬的生成量及速度，来研究皮肤CYP2D6酶的活性，结果表明肝匀浆和皮肤匀浆均有CYP2D6的功能表达，能够将右美沙芬转化为去甲基右美沙芬，但皮肤匀浆中转化的量少。 右美沙芬浓度在0.5～50μg/ml范围内的肝匀浆和皮肤匀浆代谢底物浓度倒数1/[s]与去甲基右美沙芬的生成速度倒数1/V呈良好线性关系，皮肤CYP2D6活性明显比肝脏低。 特比萘芬是临床常用的抗真菌药物，是CYP2D6的竞争性抑制剂，能抑制CYP2D6的代谢活性，大鼠肝和皮肤的平均抑制率分别为30.22±9.37％和33.19±7.30％。

目录

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缩略词表

摘要

前言

第一部分免疫组化法检测CYP在HaCaT细胞和健康人皮肤组织中的表达

第二部分Realtime PCR法定量检测CYPmRNA在HaCaT细胞和健康人皮肤组织中的表达

第三部分银屑病患者皮损组织CYP的芯片检测

第四部分组胺刺激HaCaT细胞后CYP的芯片检测

第五部分CYP酶在人表皮角质形成细胞中的表达调控

第六部分右美沙芬经皮肤CYP2D6代谢及特比萘芬的抑制作用

结论

参考文献

致谢

综述皮肤细胞色素P450酶的研究进展

博士期间发表论文、著作及参加的临床研究工作