心血管活性物质salusin-β的心肌保护作用及其机制研究

摘要

目的：Salusin-β是一种新发现的心血管调节肽，其心血管效应远未阐明。本研究的目的是探明salusin-β是否具有抗心肌缺血再灌损伤作用及其机制。 一、实验模型和方法 1.离体心脏缺血再灌损伤模型 离体大鼠心脏悬挂于Langendorff系统后以95％O2+5％CO2饱和的KH液进行逆行恒压(80cmH2O)灌流。将前端带有球囊的导管经左心房插入左心室，通过调节球囊的体积将左室舒张末压调至6mmHg。经过25min的平衡灌流后，全心停灌45min后复灌30min。salusin-β预处理组于停灌前5min给予10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/Lsalusin-β。 2.心肌细胞缺氧复氧模型 以fluo-3/AM负载的大鼠心室肌细胞用100％O2饱和的台氏液液灌流15min后，用1mmol/LNa2S2O4引起化学缺氧的无糖台氏液灌流15min作为缺氧，然后转换成氧合(100％O2)台氏液灌流10min，作为复氧过程。10-8mol/Lsalusin-β在缺氧复氧前5min开始灌流。 3.无钠外液灌流引起的钙超载模型 用酶解法分离大鼠心室肌细胞，以fluo-3/AM为钙指示剂，对照组心肌细胞台氏液灌流15min后换以无钠台氏液灌流10min，10-8mol/Lsalusin-β在无钠台氏液灌流前5min开始灌流。 4.心肌细胞全细胞电流记录 将酶解法分离得到的细胞悬液加入细胞池内，并以1ml/min的速度用细胞外液灌流。玻璃微电极由自动拉制仪(P-97)制备，用电极内液充灌，电极电阻通常为2-4MO，形成高阻封接前补偿液结电位，补偿快电容后再用较大负压吸破细胞膜，补偿电容电流和电极串联电阻，形成全细胞记录模式。串联电阻补偿70-90％。在电流钳模式下记录动作电位，在电压钳模式下记录各种电流。所有实验均在室温(20-23℃)进行，信号经Ag/AgCl电极引导，由膜片钳放大器(EPC10，德国)放大，计算机通过软件(Pulse/Pulsefit)经模/数转换系统采集数据，用Igor程序进行数据分析。 二、主要结果 (一)Salusin-β对离体大鼠心脏缺血再灌后心功能的影响 在缺血停灌前期间，各阻心率、冠脉流量以及各项心功能观察指标基本保持恒定，各组间各指标无显著差别。心率、冠脉流量复灌时显著低于停灌前，后逐步恢复，各组心率无显著差别。 (二)Salusin-β对缺氧复氧和无钠外液灌流引起的心肌细胞钙超载的影响 1.对照组心肌细胞胞内钙离子浓度(以相对值表示，缺氧前为1)缺氧后10min内逐步上升，10min时为1.36±0.14，缺氧后期胞内钙离子浓度迅速上升，15min时为1.69±0.17，复氧后胞内钙离子浓度进一步上升，复氧后2min为1.79±0.22，复氧后期胞内钙离子浓度保持相对稳定。 10-8mol/Lsalusin-β组心肌细胞在缺氧复氧期间胞内钙离子浓度上升的速度要慢于对照组，缺氧10min、15min胞内钙离子浓度分别为1.10±0.18(p＜0.01vscontrol)和1.34±0.28(p＜0.01vscontrol)，复氧2min时为1.51±0.25(p＜0.01vscontrol)，均显著低于对照组。以上结果表明salusin-β可以减轻缺氧复氧引起的心肌细胞钙超载。 2.对照组和salusin-β组心肌细胞内钙离子浓度在台氏液灌流期间无明显差别，而用无钠台氏液灌流后，对照组心肌细胞胞内钙离子浓度迅速上升，10min时为1.49±0.13，而10-8mol/Lsalusin-β组心肌细胞胞内钙离子浓度无钠外液灌流10min时为1.26±0.06，显著低于对照组(p＜0.01)。以上结果表明salusin-β可以减轻无钠外液灌流引起的心肌细胞钙超载。 (三)Salusin-β对心肌细胞对动作电位(AP)、L型钙通道电流(ICa,L)、钠钙交换电流(INaCa)、钠电流(INa)、ATP敏感钾通道电流(IKATP)、瞬时外向钾电流(Ito)、持久激活钾电流(Isus)、内向整流钾电流(IK1)等电流的影响 1.在全细胞电流钳模式下记录大鼠心室肌细胞AP，10-10-10-7mol/Lsalusin-β对静息电位、动作电位幅度无明显影响。10-8mol/L和10-7mol/Lsalusin-β可以明显缩短APD50和APD90。对照APD50为43.70±6.23ms，给予10-8mol/L和10-7mol/Lsalusin-β后分别为34.55±2.88ms(p＜0.05vscontrol)和29.65±3.40ms(p＜0.01vscontrol)。对照APD90为82.29±14.55ms，给予10-8mol/L和10-7mol/Lsalusin-β后分别为60.92±4.68ms(p＜0.05vscontrol)和51.25±8.20ms(p＜0.01vscontrol)。冲洗后部分逆转salusin-β缩短APD的作用。 2.在斜坡刺激中以对Ni2+敏感部分的电流作为INaCa。Salusin-β对内向、外向INaCa均有抑制作用，10-8mol/Lsalusin-β使心室肌内向INaCa(-100mV)从-3.94±0.66pA/pF降为-2.47±0.41pA/pF(p＜0.05)，使外向INaCa(+50mV)从2.93±0.42pA/pF降为2.02±0.35pA/pF(p＜0.05)。 3、Salusin-β呈浓度依赖性抑制大鼠心肌细胞ICa,L，10-10-10-7mol/Lsalusin-β灌流5min后ICa，L分别下降6±4％、10±6％、22±6％、30±9％，后两者显著高于对照组的5±3％(p＜0.01，n=8)。10-8mol/Lsalusin-β灌流5min后Ⅳ曲线明显上移，但不改变ICa，L的电压依赖关系和反转电位。对照ICa,L激活曲线的半激活电位是-18.23±1.41mV，斜率是4.70±0.18mV，10-8mol/Lsalusin-β灌流后半激活电位是-18.84±1.55mV，斜率是4.83±0.21mV。对照ICa,L失活曲线半失活电位是-26.44±1.28mV，斜率是4.12±0.15mV。10-8mol/Lsalusin-β灌流后半失活电位是-26.99±1.36mV，斜率是4.05±0.17mV。上述结果表明salusin-β不改变L型钙通道激活和失活的门控特点。 4.在由50mV到-100mV持续125ms的斜坡刺激下记录心肌细胞KATP通道电流。10-8mol/Lsalusin-β不能使该电流增加，给予pinacidil后该电流明显增加，并且能被glibenclamide阻断(说明该电流是IKATP)。10-8mol/Lsalusin-β也不能抑制IKATP，在0mV时pinacidil使IKATP增加为6.41±1.90pA/pF，再给予salusin-βIKTP为6.24±1.86pA/pF，两者无统计学差别(p＞0.05，n=8)，提示salusin-β即不能使静息状态下的KATP通道开放，也不能使已经开放的KTP通道关闭。 5.Salusin-β使ItoⅠ-Ⅴ曲线上移，10-8mol/Lsalusin-β灌流后5min后去极化全30mV、40mV、50mV、60mV时的Ito电流密度值分别为7.84±1.10pA/pF、9.41±1.22pA/pF、11.30±1.49pA/pF和13.11±1.74pA/pF，均显著高于对照组的6.51±0.89pA/pF、7.82±0.98pA/pF、9.40±1.04pA/pF和10.87±1.26pA/pF(p＞0.05，n=6)，冲洗后基本恢复。Isus在给予salusin-β后未发生明显改变。 6.Salusin-β对IMa峰值、到达峰值时间、Ⅳ曲线、反转电位无明显影响。 7.心肌细胞超级化至-120mV时的IK1为21.95±4.17pA/pF，10-8mol/Lsalusin-β灌流后10minIK1为21.93±4.10pA/pF，两者无统计学差别(P＞0.05，n=6)。Salusin-β不改变IK1的Ⅰ-Ⅴ曲线形态，也没有使其向左右移动或上下移动 三、结论 本工作在离体灌流大鼠心脏缺血再灌损伤模型中，观察到salusin-β能够显著改善复灌后心功能指标；在缺氧复氧和无钠外液灌流引起的心肌细胞钙超载模型中，观察到salusin-β可以显著减轻心肌细胞钙超载；在研究salusin-β对心肌细胞动作电位、通道电流的影响中，观察到salusin-β能够显著缩短动作电位时程，抑制钠钙交换电流和L型钙通道电流，增加顺时外向钾电流，而对ATP敏感钾通道电流、内向整流钾电流、持久激活钾电流、钠电流无明显影响。上述结果表明salusin-β具有抗心肌缺血再灌损伤、改善缺血再灌后心功能的作用，该保护作用可能主要或至少部分与减轻心肌细胞钙超载有关，其离子通道电流机制可能与salusin-β的抑制钠钙交换电流、L型钙通道电流(直接减少钙内流)和增加瞬时外向钾电流、缩短动作电位(间接减少钙内流)的作用有关。

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及学位论文使用授权书声明

英文缩写及英汉全称

摘要

前言

第一部分Salusin-β对缺血再灌注心肌损伤的影响

第二部分Salusin-β对缺氧复氧和无钠外液灌流引起的心肌细胞钙超载的影响

第三部分Salusin-β对心肌细胞动作电位及通道电流的影响

一、前言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

参考文献：

结论

致谢

在读期间发表论文情况：

心肌细胞内皮素的信号传导