游离的LIFRα胞内功能片段对HL-60细胞的生长调节

摘要

研究背景和目的:白血病抑制因子(LIF)是一种多效性细胞因子，作用于多种细胞组织发挥不同的生物学作用，广泛调节细胞的生长、增殖和分化。如抑制胚胎干细胞的体外分化；刺激血小板生成，造血细胞增殖；促进成骨细胞增殖；促进神经原形成，肌肉卫星细胞的增殖，参与神经肌肉修复；参与肝的急性期反应，参与炎症的生理病理过程等。这些生物学效应有赖于其结合靶细胞膜上的LIF受体α亚基(gp190)，与另一亚基(gp130)形成异源性二聚体，激活下游信号转导通路。gp190(LIFRα亚基)是低亲和力的LIF特异性受体，属于造血细胞素受体超家族，缺乏内生激酶的活性。生理状态下存在可溶性LIFR和跨膜LIFR。可溶性受体，游离于胞外，无跨膜区和细胞内区，对LIF发挥的正常生理效应有拮抗效应。跨膜LIFR(gp190)胞内区含三个功能域——BOX1、2、3。YXXQ序列位于远膜端(Y酪氨酸，X任意氨基酸，Q谷氨酰胺)，与STAT3的SH2位点特异性识别结合。细胞内是否存在胞内区游离受体，胞内区受体游离后如何影响信号传递，发挥其生物学效应?有关膜受体信号启动位点的游离多肽对细胞增殖分化的影响已有报道，提示我们，单一亚基的单一信号启动位点在离膜状态下完全能够在细胞内启动相应的信号转导通路。LIF信号传导激活JAK-STAT途径和RAS-MAPK途径，我们前期研究根据gp190细胞内区的不同功能域分别设计了两种小分子——190CT2+3(含BOX2+3)和190CT3(含BOX3)，发现gp190细胞内区的多个功能域成为游离多肽在细胞内存在时，对细胞分化有不同的影响，激活不同的信号分子。为进一步验证前期工作，研究发生机制，本研究成功获得了重组190CT2+3和190CT3两种白血病HL-60细胞株，并进一步对190CT3的YXXQ基团定点突变研究相关信号转导通路，发现稳定表达重组目的基因(190CT2+3和190CT3)的肿瘤细胞，增殖均受到抑制，促进细胞成熟分化，JAK/STAT3通路激活；通过该研究，我们明确了gp190不同的功能域190CT2+3、190CT3在胞内游离存在时，对急性早幼粒白血病细胞HL-60增殖分化的功能效应和相关信号通路；有利于探索受体细胞内区单一功能域的应用价值，以诱导干细胞同步定向分化，希望获得一定数量的专能干细胞。 第一部分重组人LIFR胞内游离片段的白血病HL-60细胞的获得与鉴定方法：(1)酶切初步鉴定已构建的重组质粒PCDNA3.0-190CT2+3、PCDNA3.0-190CT3，进一步测序；(2)将重组载体用FuGENE-6脂质体体外转染白血病HL-60细胞，含G-418完全培养基以梯度稀释法筛选阳性克隆15d，设转染pcDNA3.O空质粒载体和野生型HL-60细胞为对照实验细胞。转染组细胞LIFR目片段表达量的鉴定：挑选生长旺盛的克隆，以免疫细胞化学，蛋白印迹法进行蛋白水平的定量检测，确定稳定表达的细胞株，以备后面实验使用。(3)观察各组细胞生长状态，绘制生长曲线；免疫印迹法检测增殖核抗原PCNA；流式细胞仪检测成熟粒细胞相关抗原CD15；免疫细胞化学检测STAT3。结果：(1)BamHⅠ、XbaⅠ双酶切，电泳紫外灯下观察可见大小相符的目的片段，测序结果与Genbank核酸序列数据库中LIFR序列(X61615)比对，完全一致，已正确构建重组人LIFR胞内游离片段的真核表达质粒。(2)经G-418筛选重组190CT2+3、190CT3的HL-60细胞和空质粒转染细胞，用免疫印迹法检测LIFR，于20KD、15KD处见目的蛋白条带，选取稳定表达的细胞株进行下一步实验。免疫细胞化学检测LIFR表达，试验组胞质阳性信号较对照组明显增强，同时试验组出现杆状、分叶核，统计学分析试验组分叶核比例，P＜0.05,组间差别有意义。(3)细胞计数，绘制生长曲线，试验组(PCDNA3.0-190CT2+3、190CT3重组子HL-60细胞株)生长速度较对照组(pcDNA3.0空质粒载体和野生型HL-60细胞)明显减慢；流式细胞仪检测CD15发现,PCDNA3.0-190CT3重组子HL-60细胞株CD15阳性细胞百分数高于转染PCDNA3.0-190CT2+3组，且均高于对照组；免疫印迹法检测两组试验组PCNA均低于对照组；免疫细胞化学检测STAT3：试验组表达较对照组增强。结论：(1)将190CT2+3、190CT3重组质粒转染HL-60细胞，用G-418筛选，单克隆培养，经检测说明重组HL-60细胞株已经稳定表达目的基因。(2)试验组分叶核的比例增加，生长减慢，CD15表达的增高和PCDA表达的降低，初步证明目的基因对HL-60细胞有促进分化，抑制增殖的作用；同时信号分子STAT3激活。 第二部分人LIFR胞内游离片段信号通路的检测方法：(1)190CT3点突变体的HL-60白血病细胞株的获得与鉴定：通过引物延伸法设计定点突变，将190CT3蛋白序列中三处YXXQ基团的酪氨酸位点突变为苯丙氨酸，构建重组表达载体pcDNA3.0-MUT。将重组质粒用FuGENE-6脂质体转染HL-60细胞，G-418梯度筛选阳性克隆，挑选生长旺盛的克隆，以RT-PCR方法进行mRNA的半定量检测，确定表达量较高的细胞株。(2)免疫印迹法检测五组HL-60细胞株中信号分子STAT3、磷酸化STAT3(T705)，JAK1，P44/42(P44/42MAPK)。(3)免疫荧光法检测信号分子STAT3和磷酸化STAT3(T705)。结果：(1)点突变PCR后获得339bpDNA片段，经BamHⅠ、XbaⅠ双酶切连接重组入质粒pcDNA3.0，双向测序后与Genbank数据库中LIFR序列(X61615)比对，插入片段的三处编码酪氨酸的cDNA序列TAT正确置换为编码苯丙氨酸的TTC，我们成功获得重组pcDNA3.0-MUT的真核表达质粒。经G-418筛选出4株重组190CT3突变体的细胞株，用RT-PCR方法检测目的基因的表达，选取表达量较高的细胞株进行下一步实验。(2)免疫印迹法检测信号分子的蛋白表达，试验组PCDNA3.0-190CT2+3、PCDNA3.0-190CT3重组子HL-60细胞株中STAT3和磷酸化STAT3明显较对照组增高，突变组表达较弱同时JAK1未见表达，P44/42的检测表达情况相反，试验组表达量较对照组明显降低。(3)免疫荧光法观测到试验组STAT3表达胞质荧光增强，试验组磷酸化STAT3胞核荧光增强；结论：(1)我们以190CT3基因片段为来源，用特异性的引物进行定点突变，得到重组pcDNA3.0-MUT的真核表达质粒。将重组体转染进入HL-60细胞，用G-418筛选，经检测说明重组的HL-60细胞株已经稳定表达pcDNA3.0-MUT，为以下的实验提供了准确、有效的实验工具。(2)目的片段190CT2+3，190CT3激活细胞内JAK-STAT3信号通路；抑制MAPK增殖信号通路。

目录

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外文缩写索引

第一部分重组人LIFRα胞内功能片段的HL-60细胞株的获得与鉴定

第二部分人LIFR胞内游离片段信号通路的检测

前言

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

参考文献

转录因子STAT3的研究进展

全文小结

致谢

已发表论文和参加会议