水溶性富勒烯衍生物合成及其辐射生物学效应研究

摘要

在辐射损伤防护工作中，重要的措施是寻找有效辐射防护剂。然而，目前国内外已有的辐射防护剂还不理想，主要问题是防护效价低、毒副作用多，而且主要针对γ射线所致的辐射损伤，对高LET的中子照射和γ射线所致复合辐射损伤的防护效果很差。 电离辐射对生物体构成损伤，主要来自两方面的作用：一是辐射能量传递的直接作用，二是间接作用。电离辐射造成的生物体损伤主要是由于其间接作用引起的。辐射防护剂研究的主要思路是从缓解和阻断辐射所致大量自由基的间接作用，从而提高机体抗放能力。因此，清除自由基成为辐射防护研究的重点。 富勒烯是由60个碳原子组成中空笼状结构的碳的第三种同素异型体。实验证明超氧化物游离基被多羟基富勒醇俘获，俘获效率可高达85％。已有研究表明富勒烯及其衍生物吸收自由基，保护缺血再灌注对人神经细胞、肺上皮细胞的损伤，保护紫外线对人角化细胞损伤。 尽管富勒烯被喻为“吸收游离基的海绵”，但由于富勒烯水溶性很低，阻碍了其在生物学上的应用，解决富勒烯水溶性的方案以往主要有以下三种措施：①制备富勒烯水溶性包结物；②制备富勒烯水溶胶；③在富勒烯碳笼上添加水溶性基团，合成制备富勒烯的水溶性衍生物。三种方法中以制备水溶性富勒烯衍生物最具有前景。 本课题首先合成制备富勒烯衍生物，研究该衍生物清除自由基的能力及其规律。之后，评价该衍生物对细胞的毒性作用，选出水溶性富勒烯安全使用浓度。观察分析富勒烯衍生物对γ射线照射后细胞活力的变化，初步阐明富勒烯对细胞的辐射保护作用，为研制基于富勒烯为背景的新型辐射防护剂提供前期基础研究。 一、研究内容： 1.合成制备功能化水溶性富勒烯衍生物。设计在富勒烯基团上添加各种不同的衍生基团，提高富勒烯的亲水性。尝试：①丙二酸与二甲基氨基丙胺通过DCC羧合，以1-HOBT作为消旋剂方案；②丙二酰氯与二甲基丙胺的直接反应；③丙二酸二乙酯与二甲基氨基丙胺的胺解反应，合成N1，N3-bis(3-(dimethylamino)propyl)malonamide。尝试酰胺的溴化，通过NaH或者DBU做碱，与富勒烯合成目标化合物，以及合成酰胺通过DBU做碱，CBr4作为自由基直接合成目标化合物两种实验方案，优化选择后一种实验方案作为合成目标化合物的实验方案。合成化合物通过氢谱，碳谱，质谱以及紫外做出表征。同时合成目前合成技术成熟，水溶性较好，具备一定清除自由基能力的羧酸富勒烯衍生物C3。 2.研究水溶性富勒烯对自由基的清除能力。通过spin-tranping合并应用ESR研究化合物对羟自由基的清除效果。检测不同浓度富勒烯衍生物C3对芬顿体系产生的羟自由基的清除能力，求出特征值，寻找作用规律和最适条件。 3.评价该富勒烯衍生物对细胞的毒性影响通过台盼兰拒染实验及PI单染检测富勒烯羧酸衍生物对细胞毒性及细胞增殖活力变化的影响。观察不同浓度富勒烯衍生物对细胞的毒性效应，从中确定无毒性作用，或者几乎无影响，同时又具有很强自由基清除作用的合适浓度，为下述各项生物学研究奠定实验基础。 4.探索富勒烯衍生物对细胞的辐射防护效应。选取合适的细胞株，细胞与一定浓度的富勒烯衍生物共孵育，观察：①不同富勒烯衍生物浓度，对γ射线照射的保护作用。②相同富勒烯衍生物浓度对不同照射剂量的保护作用，③相同富勒烯衍生物浓度，照前照后不同时间加药对细胞的保护效应。④相同浓度，相同照射条件对不同细胞系的辐射防护作用。 二、结果 1.新型富勒烯衍生物的合成富勒烯的水溶性很低，严重阻碍了富勒烯生物学利用。我们利用打开富勒烯碳笼上的双键，通过Bingle加成反应添加水溶性基团，合成富勒烯衍生物。分别尝试3种实验方案，优化选择通过丙二酸二乙酯和二甲基氨基丙胺胺解合成前体化合物N1，N3-bis(3-(dimethylamino)propyl)malonamide，通过Bingle1+2反应将衍生基团添加到富勒烯上生成富勒烯衍生物，通过碱性氧化铝柱层析得到产物。 所生成的化合物通过氢谱(1H-NMR)、碳谱(13C-NMR)、紫外(UV-vis)以及质谱(ESI)确定其为目标化合物，建立了富勒烯单加合物合成技术平台。我们还参考文献，合成目前技术相对成熟，水溶性较好羧酸富勒烯衍生物C3. 2.羧酸富勒烯衍生物C3清除自由基能力的研究：羟自由基是生物体系中活性最强的自由基，研究合成目标化合物对羟自由基的清除效应可以从一个侧面衡量富勒烯的辐射防护效应。DMPO作为自旋捕捉剂，研究合成目标化合物对芬顿体系产生的羟自由基的清除效果。结果显示当富勒烯衍生物浓度为1mg/ml时，对3mM亚铁离子芬顿体系产生的羟自由基的清除率为93％。 3.羧酸富勒烯衍生物的放射生物学效应初步探讨：选取水溶性富勒烯羧酸衍生物C3(以下简称C3)，进行生物学效应研究。1).C3对细胞存活率和增殖的影响 通过台盼兰拒染技术，研究了C3对细胞存活率的影响。实验表明，C3浓度在0-400μg/ml范围内并没有明显的降低AHH-1的活存率(P＞0.05)。通过PI染色检测C3对细胞凋亡的影响，C3浓度1-1000μg/ml时，C3与AHH-1细胞共同孵育2h，12h，48h，细胞凋亡率没有显著变化。这些结果说明羧酸富勒烯衍生物C3对细胞毒性较低。 C3与人淋巴母细胞AHH-1共同孵育48小时后，C3浓度在0-100μg/ml范围内，对细胞增殖存在一定的抑制效应，并呈剂量依赖性；而C3浓度在100-400μg/ml范围内虽仍然对细胞增殖有抑制效应，但是并没有进一步提高富勒烯的增殖抑制效果(P＞0.05)。说明富勒烯对细胞的增殖抑制作用可能存在一定的效应阈值。2).C3对辐照细胞存活率和凋亡率的影响 照前2h使用不同浓度的C3与人淋巴母细胞AHH-1孵育，4Gy照射，台盼兰拒染实验检测细胞生长分数和细胞存活率的变化，以及通过PI单染检测细胞凋亡的变化。结果表明C3在10μg/ml时即可提高细胞的生长分数，当C3浓度提高为400μg/ml时仍可以提高细胞的生长分数；但是浓度过高，达到600μg/ml时，细胞的生长分数反而下降。 C3可以明显的提高照后人淋巴母细胞的存活率。在200-400μg/ml时，其保护效率很高，细胞存活率接近未照射组细胞水平。PI单染检测细胞凋亡的变化，得到与台盼兰拒染实验类似的结果，C3浓度在10-200μg/ml范围内，可以降低辐照细胞的凋亡率，呈药物浓度依赖性；当富勒烯羧酸衍生物浓度达到200μg/ml时，凋亡细胞的比例下降为10.49±0.53％，接近未照射组细胞(8.6±0.75％)水平，远远低于未用药照射对照组凋亡细胞的比例(26.30±0.74％)，两者差别非常显著(P＜0.01)。说明照前给药，富勒烯羧酸衍生物可以较好的保护人淋巴母细胞。 研究还发现，照前，照后加入200μg/ml浓度的富勒烯羧酸衍生物与AHH-1共孵育后，C3对相同剂量照射的细胞都存在着一定的保护作用。照前给药，可以较明显地降低细胞的死亡率和凋亡率，单纯照射组细胞存活率约为80％，照前给药组可以提高到89-91％；照后给药也可以小幅度的提高照射细胞的细胞存活率，照后给药组可以提高至83％-84％，降低凋亡比例，但比起照前给药组提高效果相差较多。同时研究表明C3对不同细胞系都存在一定的保护效应。 3、讨论辐射引发的生物效应，辐射对机体的损伤，主要通过间接作用。间接作用主要是通过水的原发辐射产物如：H.，0H.，e.aq，H202等自由基对生物大分子的作用，引起后者的损伤。目前辐射防护研究主要集中在使用自由基清除剂，清除电离辐射所致的自由基，从而达到辐射防护的目的。 富勒烯及其衍生物的6-6键是化学修饰反应活性位；由于C60分子中除碳原子外没有其它原子，所有C-C键都固定在球壳表面，它不可能发生取代反应。富勒烯有低能量的LUMO轨道，电子亲合势为2.65eV，循环伏安法测定它最多可以接受6个电子，反应中表现出缺电子烯烃的性质；它可以发生氧化还原、亲核加成、[n+2]环加成等反应；所以能够大量清除氧自由基。可是富勒烯的水溶性很低，严重阻碍了富勒烯生物学利用。合成制备水溶性的富勒烯衍生物，清除射线所产生自由基，从而从源头抑制射线所产生的间接作用，保护生物组织，可以用于开发新型辐射防护剂。 本课题通过打开富勒烯碳笼上的双键和加成反应，在富勒烯碳笼上添加水溶性基团，通过Bingle1+2反应将衍生基团添加到富勒烯上生成新型富勒烯衍生物，还合成了水溶性较好羧酸富勒烯衍生物C3，建立了富勒烯单加合物合成技术平台。 羧酸富勒烯C3水溶性比较高，DuganLL等研究表明其可以清除自由基保护神经细胞。本实验研究表明富勒烯羧酸衍生物C3对自由基存在比较好的清除效果，这一特性预示富勒烯羧酸衍生物C3可能对电离辐射存在比较好的辐射防护效应，这在我们的研究中得到初步证实，它可以显著降低辐照细胞的死亡率，减少受照细胞的凋亡。尽管它对细胞的增殖存在浓度依赖性的一定抑制作用，但是对细胞的存活率几乎没有影响，即使在较高浓度时也未明显降低细胞的活存率，说明它对细胞的毒性很小。上述结果提示，羧酸富勒烯C3可以有效清除射线所产生自由基，保护生物细胞，减轻细胞的辐射损伤。合成低毒、水溶性高、清除自由基能力强的新型富勒烯衍生物，是今后研究新型辐射防护剂的一个重要发展方向。

目录

论文说明：缩略词

独创性声明及学位论文使用授权书声明

第一部分：水溶性富勒烯衍生物的合成与表征

第二部分：富勒烯羧酸衍生物C3清除自由基能力研究

第三部分：富勒烯羧酸衍生物C3放射生物学效应研究

全文总结

论文参考文献

文献综述一 富勒烯衍生物的生物学应用

文献综述二 富勒烯的化学和物理

文献综述三 富勒烯C60/C70的制备化学

第一作者发表文献：

致谢