东海厚壳贻贝水溶性多糖MP-Ⅰ的结构鉴定及生物学活性研究

摘要

多糖是一类广泛存在于动植物、微生物中的重要的生物大分子物质。随着分子生物学研究的不断深入，人们逐渐发现不同来源的多糖具有广泛而复杂的生物学活性，多糖的研究已引起了医药界的高度重视，并成为当今生命科学研究的热点之一。美国于2001年启动了“功能糖组学计划”，日本也开展了“糖工程前沿计划”，其整体目标是阐明糖链的生物学功能，并设计出治疗心血管疾病、癌症、感染性疾病等多糖类药物。我国对多糖类的研究起步较晚，但进展迅速，尤其在多糖类的生物学功能研究方面取得了较快的进展。 海洋是生物多糖的一个重要来源地，随着对陆地植物、真菌多糖的大量开发，海洋生物多糖也越来越引起人们的注意。目前海洋多糖的开发研究较多集中在海洋植物，多种海藻多糖的结构得到了阐明并被发现具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗放射性、抗衰老等作用。而对海洋动物多糖的相关研究报道则较少。 厚壳贻贝(Mytilus coruscus)属于海洋软体动物门，双壳纲，贻贝目，贻贝科，盛产于我国渤海、黄海等海域，在我国北方称海红，江浙一带称淡菜。已有研究表明，贻贝提取物有抗肿瘤、抗衰老、抗病毒、抗酒精性肝损伤和抗菌的功能和增加机体免疫能力、降低血脂含量的功效。而多糖是其中重要的有效活性成分之一。 我室对海洋动物多糖的研究已有多年的基础，本文主要对东海厚壳贻贝多糖MP-Ⅰ(Mytilus coruscus polysaccharide MP-Ⅰ)进行了分离纯化、结构鉴定及生物学活性研究。 1.MP-Ⅰ的分离纯化。通过新鲜厚壳贻贝肉组织匀浆、热水抽提、水提液Sevag法除蛋白的方法得到多糖粗品。多糖粗品经DEAE-Sepharose阴离子交换树脂分离，Sepharose CL-6B凝胶反复纯化。多糖的纯度经旋光度测定和高效液相色谱法(HPLC)检测，HPLC法测定分子量。同时，对分离纯化的条件进行了优化。 2.MP-Ⅰ的结构鉴定。通过对MP-Ⅰ进行紫外(200-400nm)扫描、红外扫描、单糖组分测定(气相色谱及硅胶薄层层析)、甲基化分析、高碘酸氧化分析、核磁共振分析、糖醛酸含量测定、硫酸根含量测定，最终确定MP-Ⅰ的化学结构。 3.MP-Ⅰ的生物学活性研究。(1)MP-Ⅰ抗小鼠急性肝损伤作用的研究。将昆明小鼠随机分成6组：①正常组(生理盐水+橄榄油)；②阴性对照组(生理盐水+CCl<,4>橄榄油)；③阳性对照组(苦参素，30 mg·kg<'-1>·d<'-1>+CCl<,4>橄榄油)；④MP-Ⅰ高浓度组(MP-Ⅰ100 mg·kg<'-1>d<'-1>+CCl<,4>橄榄油)；⑤MP-Ⅰ中浓度组(MP-Ⅰ 50 mg·kg<'-1>·d<'-1>+CCl<,4>橄榄油)；⑥MP-Ⅰ低浓度组(MP-Ⅰ 25 mg·kg<'-1>·d<'-1>+CCl<,4>橄榄油)。实验室常规饲养3 d后，各组小鼠腹腔注射不同药物0.2ml/只：正常组和阴性对照组注射生理盐水、阳性对照组注射苦参素、MP-Ⅰ三个组分别注射不同剂量的多糖。连续7d，末次注射2h后，空白对照组腹腔注射0.2ml/20g的橄榄油，其余各组腹腔注射0.2ml/20g剂量的0.2％CCl<,4>橄榄油溶液，制备急性肝损伤模型。24h后各组小鼠眼眶取血，颈椎脱臼法处死后取肝，测定各组小鼠肝指数、血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)，肝组织匀浆超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)水平。光镜下观察肝组织切片的病理学变化。(2)MP-Ⅰ对肿瘤细胞生长抑制作用的研究。设立MP-Ⅰ三个浓度组(500pμg/ml、100μg/ml、20μg/ml)分别作用于体外培养的HO-8910、MCF-7、K562、SMMC-7721、HL-60、Hela六种肿瘤细胞，MTT法测定不同浓度MP-Ⅰ对肿瘤细胞生长的抑制作用。 实验结果显示，经过分离纯化后得到的贻贝多糖纯品MP-Ⅰ为白色粉末，水溶性佳，分子量为1350KDa。经分离纯化条件的优化，缩短了分离纯化的时间，纯多糖得率提高至贻贝鲜组织的2.14％。 结构鉴定表明，MP-Ⅰ是以α-D-(1→4)Glc为主链，α-D-(1→6)Glc连接为侧链的葡聚糖，其化学结构为： 抗小鼠急性肝损伤结果表明，MP-Ⅰ高浓度组(100 mg·kg<'-1>·d<'-1>)能显著降低CCl<,4>急性肝损伤小鼠血清谷丙氨酸(ALT)、谷草氨酸(AST)水平(P<0.01)，降低肝组织丙二醛(MDA)水平(P<0.01)，增高肝组织超氧化物岐化酶(SOD)水平(P<0.01)。中浓度组(50 mg·kg<'-1>·d<'-1>)能显著降低CCl<,4>急性肝损伤小鼠血清ALT(P<0.01)、AST水平(P<0.05)，降低肝组织MDA水平(P<0.05)，增高肝组织SOD水平(P<0.01)。MP-Ⅰ低浓度组(25 mg·kg<'-1>·d<'-1>)能显著降低CCl<,4>急性肝损伤小鼠血清ALT水平(P<0.01)，但对血清AST、肝组织MDA和SOD水平无显著影响(P>0.05)。阳性对照组(30 mg·kg<'-1>·d<'-1>)能显著降低CCl<,4>急性肝损伤小鼠血清AST水平(P<0.01)，降低肝组织MDA水平(P<0.05)，增高肝组织SOD水平(P<0.05)，但对血清ALT水平并无显著降低作用(P>0.05)。肝脏病理组织学显示，MP-Ⅰ能明显抵御肝损伤小鼠肝细胞坏死和炎症细胞入侵，改善肝脏病理学损伤程度，且与剂量呈正相关。但各组小鼠的肝指数无显著差异。体外抑制肿瘤细胞生长作用研究表明，MP-Ⅰ三个浓度组对体外HO-8910，MCF-7，K562，SMMC-7721四种肿瘤细胞均有不同程度的生长抑制作用(P<0.01)，其中高浓度组对HO-8910、MCF-7肿瘤细胞的抑制率分别为30.55％和36.38％。 结论：获得分子量为1350 KDa的多糖纯品MP-Ⅰ；MP-Ⅰ是以α-D-(1→4)Glc 为主链，α-D-(1→6)Glc为支链的葡聚糖：MP-Ⅰ对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤有显著的保护作用，与剂量呈正相关；MP-Ⅰ对体外肿瘤细胞的生长有抑制作用，对HO-8910，MCF-7肿瘤细胞的生长抑制作用最为显著。

目录

论文说明：缩略词表

声明

摘要

前言

第一部分贻贝水溶性多糖MP-Ⅰ的分离纯化及分子量测定

第二部分贻贝水溶性多糖MP-Ⅰ的结构分析

第三部分贻贝水溶性多糖MP-Ⅰ的生物学活性研究

结论

参考文献

致谢

综述：动物粘多糖的分离提取及生物学活性研究

附录