核苷酸焦磷酸酶基因多态性与脊柱后纵韧带骨化程度及骨化进展相关的初步研究

摘要

后纵韧带骨化(ossification of posterior longitudinal ligament,OPLL)是一种起源于韧带组织的异位骨化性病变。1938年,Key第一次描述了颈椎的后纵韧带骨化可引起脊髓受压而产生临床症状。其病因至今仍未明了,先后有学者提出了椎间盘变性学说、钙代谢异常学说、机械损伤学说,等等。至今仍都停留在推测及学说阶段。随着分子生物技术以及基因技术的迅速发展并应用于医学领域,众多学者希望从分子水平甚或基因水平上找到OPLL的发病基础,以及基因变化与病情演变、预后甚至骨化进展的关系,力求从根本上解释临床出现的诸多问题。研究发现核苷酸焦磷酸酶(Nucleotide pyrophosphatase,NPPS)基因多态性、人类α2胶原(human collagen alpha2(XI),COL11A2)等基因的多态性在后纵韧带骨化起始、形成以及骨化程度均有一定程度的影响。 Koga等研究证明OPLL致病基因位于靠近HLA复合体第六号染色体上。为此,Okawa等利用TTW大鼠模型研究发现:TTW大鼠的OPLL表型是由于NPPS基因无意义突变造成的。TTW大鼠具有与人类的后纵韧带骨化相类似遗传素质,易于发生后纵韧带骨化,常作为研究后纵韧带骨化的动物模型。NPPS基因编码核苷酸焦磷酸酶,从而调节软组织的钙化和骨矿物质的沉积。核苷酸焦磷酸酶是无机焦磷酸盐(PPi)产生的主要作用酶,PPi是机体抑制组织钙化的主要抑制剂,NPPS功能失常导致PPi水平下降,促进异位组织包括韧带组织骨化。许多报道提出NPPS基因不同位点突变与脊柱的后纵韧带骨化易感性、以及骨化程度有一定的相关性。Koshizuka等应用单核苷酸多态性(SNPs)研究的方法对部分OPLL患者的NPPS基因进行分析,并发现靠近16号外显子的15号内含子的14位“T”被“C”替代(IVS15-14T→C),其基因类型突变与OPLL的发生率以及骨化的严重程度密切相关。Tahara提出NPPS基因IVS20-11delT与OPLL的骨化发生率无明确的相关性,但在OPLL伴有胸椎后纵韧带骨化患者中有较高的发生率且有意义。目前国内均未见有关核苷酸焦磷酸酶影响骨化即羟基磷灰石沉积的机制以及微观上表达、脊柱后纵韧带骨化程度与NPPS基因多态性相关性的研究。 近来国外文献报道：颈椎OPLL手术后病人,尤其是后路术后OPLL有明显发展的迹象,且OPLL继续进展的比率高达70％左右,少数患者甚至再次出现明显的脊髓或神经受压症状。分析其原因,许多学者提出与手术导致后结构破坏,椎管的张力减小、后纵韧带承受机械应力增加有关系。有研究提出：脊柱韧带在局部应力变化的环境下,不但是应力本身造成韧带纤维等的损伤而出现异常的骨化,应力刺激亦可造成机体的应激反映而出现局部微环境的变化,即纤维细胞等出现异常的蛋白表达,包括一些能诱导纤维细胞向骨细胞分化的细胞因子,如骨形成蛋白、转化生长因子β、血管生长因子、胰岛素样生长因子I(ISGF-I)等。上述各因子能刺激骨母细胞DNA合成、毛细血管侵入,使前胶原蛋白合成增加,在OPLL患者的后纵韧带细胞中选择性诱导成骨分化,在后纵韧带细胞上受体数目增多,进而影响胶原在韧带骨化不同区域的表达、骨化进展等病理生理过程。然其发生机制又是如何?TTW大鼠作为研究后纵韧带骨化的动物模型,其骨化程度随鼠龄增长逐渐加重而最终导致大鼠的脊髓直接受压瘫痪,NPPS基因突变可能与TWY大鼠的骨化进展呈直接相关。人类OPLL进展是否与NPPS基因的某些外显子或内含子的核苷酸序列的多态性变异有关?影响骨化进展的相关综合因素有哪些?目前有关OPLL术后骨化进展与NPPS基因突变之关系国内外未见报道。 目的：综合分析OPLL患者骨化程度以及骨化术后进展的相关因素,并通过PCR、SNPs等技术分析其NPPS基因多态性与骨化发生率、骨化程度以及骨化术后进展的相关性,结合电镜扫描结果了解核苷酸焦磷酸酶影响羟基磷灰石沉积及骨化的具体机制。从病理免疫组化实验上了解骨化组织骨化进程及成骨细胞因子与骨化进展的关系。进而更加全面了解OPLL的发生机制,尤其是骨化程度及骨化进展的情况,为临床诊治尤其是OPLL术后骨化进展患者提供确实可行的实验证据。 方法： (1)综合分析与脊柱后纵韧带骨化程度相关的因素,收集95例收治的后纵韧带骨化患者的外周血液和90例的非后纵韧带骨化患者的外周血液,通过聚合酶链反应(PCR)、单核苷酸多态性(SNPs)方法检测核苷酸焦磷酸酶基因的四个相关位点的多态性；并比较分析OPLL患者骨化发生率、骨化程度与NPPS基因多态性的相关性,结合电镜扫描结果了解NPPS基因影响韧带骨化的机制。 (2)分析获得随访的39例脊柱后纵韧带骨化术后骨化进展患者的相关资料,测量其骨化进展的相关数据,分析与OPLL术后骨化进展的相关影响因素,并分析其与NPPS基因的四个突变位点的相关性。 (3)通过对手术获得的30例颈椎后纵韧带骨化患者的后纵韧带骨化标本进行组织病理学和免疫组化试验,比较分析不同骨化类型其骨化的组织病理学变化情况、骨化的连续进程具体分区以及成骨细胞因子在骨化局部分布情况,了解成骨细胞因子与骨化术后进展的相关性。 结果： (1)脊柱后纵韧带骨化类型与骨化程度即骨化厚度和骨化椎节数有一定的相关性,脊柱后纵韧带骨化程度与颈3后纵韧带骨化及胸椎后纵韧带骨化有一定的相关性,故颈3后纵韧带骨化、胸椎后纵韧带骨化可作为骨化程度的相对指标。选择并检测NPPS基因以下四个基因突变位点:A533C(exon4,533A→C)、IVS15-14T→C(intron15,-14T→C)、C973T(exon9,973C→T)、IVS20-11delT(intron20,-11 deletion T)。结果表明核苷酸焦磷酸酶基因多态性与脊柱后纵韧带骨化的发生率、骨化程度有一定的相关性。其中骨化的发生率与NPPS基因IVS15-14T→C位点变化相关性更为密切,而NPPS基因IVS20-11delT位点变化与脊柱后纵韧带骨化的程度关系相对较为密切。在胶原纤维内可见散在的由纤维细胞转化而来类软骨样细胞以及羟基磷灰石沉积。 (2)影响脊柱后纵韧带骨化术后进展的影响因素有多方面：手术方式是影响骨化进展的首要因素,前路手术后骨化进展显著少于后路手术；其次为伴颈3后纵韧带骨化；患者年龄是第三因素,年轻的连续型或混合型骨化患者术后骨化进展度相对较高。NPPS基因多态性与骨化进展有一定的相关性:NPPS基因内含子20上游第11位的T碱基缺失IVS20-11delT(intron20,-11 deletion T)与OPLL术后骨化进展有显著的相关性,并且与颈3后纵韧带骨化相关密切,其具体的产生机理尚无法明确,可能与内含子的修饰功能有关。 (3)后纵韧带骨化病理呈现明显的连续进程：可分为骨化区、钙化软骨区、纤维软骨区和纤维区。连续型骨化与局限型骨化病理略有不同。骨化标本免疫组化实验显示：在骨化进程的各区域内有关成骨因子如骨形成蛋白2、转化生长因子β、Ⅰ型Ⅱ型胶原以及血管生长因子的表达重点不同,与骨化发展过程相关密切。Ⅰ型胶原主要在骨化区内表达,Ⅱ型胶原及TBFβ主要在钙化软骨区内表达,BMP2主要在纤维软骨区内表达,血管生长因子主要在纤维区及交界处表达。OPLL术后骨化进展与局部细胞因子关系密切,BMP2与TGF-β协同作用促进骨化进展。OPLL患者手术方式与骨化进展有显著的相关性。手术方式选择需综合考虑患者的年龄、患者术前脊髓神经功能,而骨化局部因素以及有关术后骨化进展的相关因素需综合考虑。 结论： (1)脊柱OPLL骨化程度与骨化类型、伴颈3后纵韧带骨化以及胸椎后纵韧带骨化相关密切；脊柱OPLL的发生率及程度与NPPS基因多态性有一定的相关性。 (2)脊柱OPLL术后骨化进展与手术方式、颈3后纵韧带骨化以及患者年龄相关；NPPS基因多态性与OPLL术后骨化进展有显著的相关性,并可能是导致骨化进展的根本原因。 (3)骨化局部成骨细胞因子的表达是影响OPLL术后骨化进展的局限型因素,BMP2与TGF-β协同作用促进骨化进展。

目录

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声明

摘要

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英文详细摘要

概述

第一部分：后纵韧带骨化发生率、程度与NPPS基因多态性的相关性分析及NPPS影响钙盐沉积机制探讨

前言

一、实验一材料和方法

二、实验二材料与方法

三、实验一结果

四、实验二结果

五、讨论

四、结论

参考文献

第二部分：后纵韧带骨化术后进展相关因素分析及与NPPS基因多态性的相关性分析

前言

一、材料

二、结果

三、讨论

参考文献

第三部分：病理与免疫组化实验结果分析及与骨化进展的相关性探讨

前言

一、骨化组织病理HE染色

二、免疫组化实验

三、讨论

四、结论

参考文献

总结

脊柱后纵韧带骨化术后骨化进展研究现状

在读期间科研及参加学术活动情况

致谢

查新结论