宿主微环境在肺癌骨转移中的作用及唑来膦酸干预作用的动物实验研究

摘要

本研究分为三部分： 第一部分 骨间质细胞对不同骨转移潜能肺癌细胞生物学行为的影响 目的：约20-40％的常见肿瘤患者的骨髓中可检测到播散的肿瘤细胞,但肺癌、乳腺癌等细胞易在骨中“定居”,直至变成临床可见的骨转移,而其他常见肿瘤如胃癌肠癌等,骨转移很少见,因此骨间质环境可能在骨转移中扮演一定作用。我们研究骨间质细胞对不同骨转移潜能肺癌细胞生物学行为的影响,探讨其在肺癌骨转移中的作用。 方法：分别利用骨间质细胞培养液(BSC)、骨髓血的上清液(BM)和常规培养液(RM)处理具有不同骨转移潜能的肺癌细胞株H460、A549和SPC-A1。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期变化及细胞凋亡率。ELISA的方法比较BSC,BM和RM间文献报道与骨转移相关因子的浓度差别。 结果:BSC和BM能明显增强骨高转移细胞株H460的增殖(BM和BSC,与RM相比,P<0.05),而对骨低转移细胞株A549和SPC-A1影响不大(BM和BSC,与RM相比,P>0.05)。人骨髓血的上清液对很少发生骨转移的舌癌细胞T8113生长无明显影响,对胃癌细胞SGC-7901甚至有增殖抑制作用。双磷酸盐Zometa(20UM)能阻断骨髓血上清液对肺癌细胞H460的促增殖作用,而P13K特异性的抑制剂Wortmannin(200nM)无明显抑制作用。H460细胞经BSC和BM处理24小时后,早期凋亡细胞和晚期凋亡/继发性坏死细胞的百分比均比RM组明显降低(P<0.01),而细胞周期无明显差别。ELISA的方法发现转化生长因子-β(TGF-β),生长因子(HGF),胰岛素生长因子-1(IGF-1),白介素-6(IL-6)和血小板衍生生长因子(PDGF)在BSC,BM,RM组间无明显差别。 结论：骨间质细胞的分泌液能促进骨高转移细胞株H460的增殖,其机制是通过减少细胞凋亡实现。尽管ELISA的方法未发现含量特别高的跟肿瘤骨转移相关的分子,但使用更加灵敏和高通量的研究方法,如双向凝胶电泳联合质谱,筛选骨间质细胞分泌液中促进骨转移的因子。值得进一步研究。 第二部分 使用高通量的技术平台研究肺癌细胞与骨基质的粘附作用 背景和目的:20％左右的肺癌患者能发生骨转移，其产生的顽固性疼痛，病理性骨折及脊髓压迫产生的瘫痪是临床上的瓶颈问题。肺癌患者中，有的在肿块很小的时期就发生骨转移，而有的则一直不发生骨转移，说明不同类型肿瘤在亲骨、定位生长和与骨基质粘附方面有明显差异，而越来越多的证据显示，粘附及细胞粘附分子在肿瘤骨转移中起重要作用。 材料和方法:通过粘附实验，发现骨高转移细胞株H460在骨间质细胞培养(HBS)液包被的器皿上的黏附能力远远高于常规培养液，继而我们使用基因芯片高通量的技术平台研究H460细胞与骨间质细胞培养液粘附后是否能调节下游基因的改变。 结果:Microarray证实，细胞株H460在骨间质细胞培养(HBS)液包被的器皿上的勃附2小时和24小时后，integrin b3, ADAMTS1等31个基因的表达持续上调。这些基因功能集中在细胞一细胞外基质黏附和信号转导途径两大类。Real-time PCR证实了基因芯片数据的可靠性。 结论:研究提示，骨高转移细胞株H460与骨间质细胞培养液的黏附作用能激活某些下游的信号转导途径和改变黏附相关分子的表达，这可能是其易于在骨中生存，进而产生骨转移的原因。 第三部分 使用骨转移动物模型研究唑来膦酸和泰素的联合干预作用 目的:建立人肺腺癌骨转移细胞株SPC-A-1BM的免疫缺陷小鼠的动物模型基础上比较唑来膦酸钠联合紫杉醇与单用紫杉醇、单用唑来膦酸钠对非小细胞肺癌(NSCLC)骨转移荷瘤鼠的治疗效应，并进一步探讨双膦酸盐可能的作用机制。 材料与方法:将人肺腺癌骨转移细胞株SPC-A-1BM，接种于40只等体重的NIH-BNX小鼠左心室，制成骨转移瘤模型。40只荷瘤小鼠随机分为四组，每组10只。接种后第8天开始用药，分别为唑来膦酸钠、紫杉醇、唑来膦酸钠联合紫杉醇和生理盐水对照，用药5周。每个小鼠每周称体重2次，记录生存情况。至第8周放血处死小鼠，留取血清样本，ELISA法检测血清I型胶原氨基末端肽(NTX)水平;骨ECT核素扫描、X线摄片，检测骨转移部位和数量;观察小鼠肺部、肝、淋巴结和肾上腺有无转移结节，用膨胀压片法计数肺部转移灶数，病理切片检查。 结果:对照组出现明显体重下降，单药唑来膦酸组、单药紫杉醇组与对照组出现短暂的体重差异，而唑来膦酸联合紫杉醇组(联合组)体重未下降，与对照组比自第3周起就有显著差异(p<0.05 ):核素显像和X线摄片结果显示:治疗组与对照组比骨转移均有显著差异((p=0.046, p=0.036 )，以唑来膦酸联合紫杉醇组骨转移较少:病理结果显示:治疗组与对照组比较骨转移有边缘性统计学差异(p=0.058 )，以单药紫杉醇组、唑来膦酸联合紫杉醇组骨转移较少;骨转归生物标记物-I型胶原氨基末端肽(NTX)检测:唑来膦酸组、唑来膦酸联合紫杉醇组降低了NTX水平，而以联合组与对照组有显著差异(p=0.017):并且唑来膦酸联合紫杉醇组未见肺转移(p=0.036);只有唑来膦酸联合紫杉醇组较对照组延长了生存期(p=0.022)。 结论:单药唑来膦酸钠、紫杉醇、唑来膦酸钠联合紫杉醇都不同程度地抑制了非小细胞肺癌的骨转移。唑来膦酸钠联合紫杉醇增强了对非小细胞肺癌骨转移的抑制作用，并且降低了溶骨细胞活性，延长了生存期。结果表明:唑来膦酸钠与紫杉醇联合治疗非小细胞肺癌骨转移有协同作用。

目录

声明

摘要1

英文摘要1

摘要2

英文摘要2

摘要3

英文摘要3

第一部分：骨间质细胞对不同骨转移潜能肺癌细胞生物学行为的影响

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二部分：使用高通量的技术平台研究肺癌细胞与骨基质的粘附作用

材料和方法

结果

讨论

参考文献

附表

第三部分：使用骨转移动物模型研究唑来膦酸的干预作用

材料与方法

结果

讨论

参考文献

结论

综述：肺癌骨转移机制研究的新方向

附表

申请学位期间发表论文、出版专著、成果获奖情况

致谢

附录